| 查看: 1545 | 回复: 3 | ||||
| 本帖产生 2 个 MolEPI ，点击这里进行查看 | ||||
| 当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖 | ||||
[求助]
急切求助感受态制备的问题，请高手指导
|
||||
|
这天制备的农杆菌和大肠杆菌感受态都没结果，郁闷死了，请高手指导，下面说我做的过程。 农杆菌的制备与转化： 菌株：EHA105 过程： 1.用挑取单菌落接种到含有50μg/ml利福平的YEB液体培养基中，28℃,200rpm振荡培养约17h。 3、将培养活化的农杆菌按1:50的比例稀释到50 ml含有50 μg/ml利福平的YEB培养基中，28℃振荡培养到OD600约0.6。 4. 将上述培养液转入灭过菌的50ml离心管中，冰浴30 min。 5、于4℃，5000 r/min离心10 min，弃上清液，用2 ml 0.05mol/l CaCl2悬浮菌体。 6、于4℃，5000 r/min离心10 min，弃上清液，用2 ml 0.05mol/l CaCl2悬浮菌体。 7、每管200 μl分装，液氮速冻，－70℃保存。 8. 加入4μl质粒（约1μg）质粒，轻轻混匀，冰浴30 min。 3、置液氮中冰冻5min，迅速移入37℃水浴中温浴5 min，再迅速冰浴2 min，之后加入500 μl液体YEB培养基，于28℃，,200rpm振荡培养5h。 4、充分活化后的混合物4℃ 5000rpm离心2min，沉淀菌体，弃去上清。 5.用新的YEB培养基重新悬浮菌体后，均匀涂布于含有50mg/l的利福平和75mg/l的SPC(载体抗性）固体培养基上，28度倒置培养24-48h。 大肠杆菌的制备与转化 1.挑单菌落接种于4ml LB 液体培养基（不含抗生素），于 37℃、250rpm 振荡培养过夜（约12小时左右）； 2. 取 1ml 过夜培养物按 1::50的稀释比例转接于50ml LB 液体培养基中，37℃振荡培养 4 小时，待细菌达到对数生长期（OD600为 0.5~0.6）； 3. 将培养液转移到两只预冷的 50ml 无菌离心管中，置冰上 10 分钟，使菌液冷却到0℃。于 4℃、5000rpm 离心 10 分钟，弃上清； 4.每只离心管加入 10ml 冰冷的 0.1 mol /l无菌 CaCl2将菌体重悬，冰浴放置 10 分钟，于 4℃、5000rpm 离心 510分钟，去上清； 5.每只离心管各加入 2ml 冰冷的 0.1 mol/l CaCl2重悬沉淀。 6.液氮速冻 置-70℃保存备用。 7.PUC19转化无结果。 |
回复此楼» 收录本帖的淘帖专辑推荐
 【分子生物】EPI帖 | 核酸方面 |
» 猜你喜欢
不合理蛙科研实验中的趣事：实验器材的 “乌龙”
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验中的趣事：和实验材料的 “斗智斗勇”
已经有0人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有264人回复
-
蛋白质检测：精准分析，解锁生物分子的密码
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之小鼠实验：严谨设计，解析生命机制的重要载体
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之重金属检测：精准筛查，守护健康与环境的防线
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之“蛙测重金属我背锅三千”
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之“鼠逃三次我发三篇SCI”
已经有0人回复
-
纳米粒度分析
已经有3人回复
-
林科院林化所招收材料与化工专业硕士，坐标南京
已经有0人回复
» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
- 大肠杆菌感受态转化子总是空载体，请高手指点
已经有55人回复
- 关于感受态制备问题请教
已经有13人回复
- 大肠杆菌电转感受态细胞的制备中遇到的问题
已经有8人回复
- 【求助/交流】革兰氏阳性菌的感受态细胞制备和转化
已经有9人回复
- 【求助/交流】请高手帮忙解决转化感受态细胞的问题
已经有8人回复
- 【求助/交流】请教一个制备感受态细胞中的问题
已经有10人回复
- 【求助】感受态细胞制备
已经有10人回复
- 【求助/交流】关于制备感受态细胞的重悬问题
已经有5人回复
- 【求助/交流】请问本身有抗性的菌株制备感受态全程需要加抗性吗
已经有9人回复
天使托
专家顾问 (职业作家)
T.Shen
-
专家经验: +57 - MolEPI: 106
- 应助: 95 (初中生)
- 贵宾: 0.263
- 金币: 16332.8
- 散金: 593
- 红花: 74
- 沙发: 9
- 帖子: 3652
- 在线: 289小时
- 虫号: 441757
- 注册: 2007-10-27
- 专业: 微生物生理与生物化学
- 管辖: 微生物
3楼2011-11-18 10:27:04
yesucao
木虫 (正式写手)
- MolEPI: 2
- 应助: 51 (初中生)
- 金币: 3877.1
- 散金: 45
- 红花: 6
- 帖子: 374
- 在线: 203.4小时
- 虫号: 810829
- 注册: 2009-07-17
- 性别: MM
- 专业: 微生物生理与生物化学
【答案】应助回帖
★ ★
amisking(金币+2, MolEPI+1): 鼓励积极应助！ 2011-11-18 18:33:00
amisking(金币+2, MolEPI+1): 鼓励积极应助！ 2011-11-18 18:33:00
|
我只制备过大肠杆菌的感受态，楼主的步骤大的方向是这样的，但是小细节方面不知道注意没有： 1、楼主按1:50的比例稀释，而且培养了4h，这个时间是不是有点长了；之前我的比例是1:100的比例，培养的时间为2.5-3h，而且摇好后可立即放到冰上 2、感受态的制备过程均是在冰上操作的，楼主只洗了1次，我一般洗2两次，第一次10-15ml，第二次6ml，100mM的氯化钙， 3、最后每管悬浮于1ml的氯化钙中，分装之前先将离心管预冷一下，再进行分装。 |
2楼2011-11-18 09:15:52
w2boluo
金虫 (小有名气)
- MolEPI: 4
- 应助: 0 (幼儿园)
- 金币: 2006.6
- 红花: 1
- 帖子: 85
- 在线: 356.3小时
- 虫号: 1083233
- 注册: 2010-08-27
- 性别: GG
- 专业: 植物生殖生物学
【答案】应助回帖
★ ★ ★
wanhscn(金币+3, MolEPI+1): Good!鼓励分享!对楼主有帮助! 2011-11-19 18:44:24
wanhscn(金币+3, MolEPI+1): Good!鼓励分享!对楼主有帮助! 2011-11-19 18:44:24
|
一般的做法，转化后都会有个复苏过程，农杆菌这个可以加800uL YEB（无抗）培养基在1.5mL EP管里摇4-6个小时再涂板；大肠杆菌这个也可以复苏45分钟以后再涂板，可以一定程度提升转化率。 此外，我们的大肠杆菌对数期标准为OD550或者600等于0.4，不要超过这个数值，不然氯化钙法的转化率降低很多。氯化钙尽量使用含有结晶水的晶体新鲜配制，市售的无水氯化钙往往不是很纯。 收获菌体的那一步，降温要均匀迅速，我们一般在制冰机里摇震3角瓶。 |
4楼2011-11-19 16:32:39
