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急切求助感受态制备的问题，请高手指导
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急切求助感受态制备的问题，请高手指导 这天制备的农杆菌和大肠杆菌感受态都没结果，郁闷死了，请高手指导，下面说我做的过程。 农杆菌的制备与转化： 菌株：EHA105 过程： 1.用挑取单菌落接种到含有50μg/ml利福平的YEB液体培养基中，28℃,200rpm振荡培养约17h。 3、将培养活化的农杆菌按1:50的比例稀释到50 ml含有50 μg/ml利福平的YEB培养基中，28℃振荡培养到OD600约0.6。 4. 将上述培养液转入灭过菌的50ml离心管中，冰浴30 min。 5、于4℃，5000 r/min离心10 min，弃上清液，用2 ml 0.05mol/l CaCl2悬浮菌体。 6、于4℃，5000 r/min离心10 min，弃上清液，用2 ml 0.05mol/l CaCl2悬浮菌体。 7、每管200 μl分装，液氮速冻，－70℃保存。 8. 加入4μl质粒（约1μg）质粒，轻轻混匀，冰浴30 min。 3、置液氮中冰冻5min，迅速移入37℃水浴中温浴5 min，再迅速冰浴2 min，之后加入500 μl液体YEB培养基，于28℃，,200rpm振荡培养5h。 4、充分活化后的混合物4℃ 5000rpm离心2min，沉淀菌体，弃去上清。 5.用新的YEB培养基重新悬浮菌体后，均匀涂布于含有50mg/l的利福平和75mg/l的SPC(载体抗性）固体培养基上，28度倒置培养24-48h。 大肠杆菌的制备与转化 1.挑单菌落接种于4ml LB 液体培养基（不含抗生素），于 37℃、250rpm 振荡培养过夜（约12小时左右）； 2. 取 1ml 过夜培养物按 1::50的稀释比例转接于50ml LB 液体培养基中，37℃振荡培养 4 小时，待细菌达到对数生长期（OD600为 0.5~0.6）； 3. 将培养液转移到两只预冷的 50ml 无菌离心管中，置冰上 10 分钟，使菌液冷却到0℃。于 4℃、5000rpm 离心 10 分钟，弃上清； 4.每只离心管加入 10ml 冰冷的 0.1 mol /l无菌 CaCl2将菌体重悬，冰浴放置 10 分钟，于 4℃、5000rpm 离心 510分钟，去上清； 5.每只离心管各加入 2ml 冰冷的 0.1 mol/l CaCl2重悬沉淀。 6.液氮速冻 置-70℃保存备用。 7.PUC19转化无结果。 |
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大肠杆菌的感受态应该是很容易做的，结合你的实验操作说说我自己的经验吧： 1、集菌的离心时间5000rpm 5min就够 2、转接之后的培养时间有些长，如果按照1:50的比例接，我一般培养2~3h就开始做感受态，感受态效果与菌的活力成正相关，不见得菌越多越好 3、CaCl2作用一次不如两次效果好，第二次重悬之后冰上孵育的时间可以尽量延长，几个小时都没有问题， 4、集菌之后的左右操作一定要保证在冰上，尽量缩短将菌体暴露于常温下 5、最后一步CaCl2重悬后，应该添加15~20%的甘油作为保护剂，然后分装保存于-80℃冰箱即可。50ml的菌，最后用5ml重悬都可以的。 |
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