| 查看: 2807 | 回复: 8 | |||
[求助]
急切求助感受态制备的问题，请高手指导
|
|
急切求助感受态制备的问题，请高手指导 这天制备的农杆菌和大肠杆菌感受态都没结果，郁闷死了，请高手指导，下面说我做的过程。 农杆菌的制备与转化： 菌株：EHA105 过程： 1.用挑取单菌落接种到含有50μg/ml利福平的YEB液体培养基中，28℃,200rpm振荡培养约17h。 3、将培养活化的农杆菌按1:50的比例稀释到50 ml含有50 μg/ml利福平的YEB培养基中，28℃振荡培养到OD600约0.6。 4. 将上述培养液转入灭过菌的50ml离心管中，冰浴30 min。 5、于4℃，5000 r/min离心10 min，弃上清液，用2 ml 0.05mol/l CaCl2悬浮菌体。 6、于4℃，5000 r/min离心10 min，弃上清液，用2 ml 0.05mol/l CaCl2悬浮菌体。 7、每管200 μl分装，液氮速冻，－70℃保存。 8. 加入4μl质粒（约1μg）质粒，轻轻混匀，冰浴30 min。 3、置液氮中冰冻5min，迅速移入37℃水浴中温浴5 min，再迅速冰浴2 min，之后加入500 μl液体YEB培养基，于28℃，,200rpm振荡培养5h。 4、充分活化后的混合物4℃ 5000rpm离心2min，沉淀菌体，弃去上清。 5.用新的YEB培养基重新悬浮菌体后，均匀涂布于含有50mg/l的利福平和75mg/l的SPC(载体抗性）固体培养基上，28度倒置培养24-48h。 大肠杆菌的制备与转化 1.挑单菌落接种于4ml LB 液体培养基（不含抗生素），于 37℃、250rpm 振荡培养过夜（约12小时左右）； 2. 取 1ml 过夜培养物按 1::50的稀释比例转接于50ml LB 液体培养基中，37℃振荡培养 4 小时，待细菌达到对数生长期（OD600为 0.5~0.6）； 3. 将培养液转移到两只预冷的 50ml 无菌离心管中，置冰上 10 分钟，使菌液冷却到0℃。于 4℃、5000rpm 离心 10 分钟，弃上清； 4.每只离心管加入 10ml 冰冷的 0.1 mol /l无菌 CaCl2将菌体重悬，冰浴放置 10 分钟，于 4℃、5000rpm 离心 510分钟，去上清； 5.每只离心管各加入 2ml 冰冷的 0.1 mol/l CaCl2重悬沉淀。 6.液氮速冻 置-70℃保存备用。 7.PUC19转化无结果。 |
回复此楼» 猜你喜欢
申请科研项目纯靠实力能成功吗？
已经有7人回复
-
极限拉扯，如何抉择
已经有14人回复
-
OpenAI又攻克数学难题了，离AI做有机合成还有多远？
已经有12人回复
-
课题组会帮你通过考核么？
已经有7人回复
-
入职后第一次管课题组的专利缴费，对账才发现官费比别人多掏了一倍
已经有6人回复
-
售一区SCI文章T0P，我:8O.551.O54,科目全,可十急
已经有9人回复
-
售SCI一区文章，我:8O5.5.1.O5.4,科目全,可伽急
已经有10人回复
-
售SCI一区T0P文章，我:8.O55.1.O.54,科目全,可十急
已经有8人回复
-
售SCI一区T0P文章，我:8.O55.1.O.54,科目全,可十急
已经有9人回复
-
售SCI一区文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可伽急
已经有7人回复
» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
- 大肠杆菌感受态转化子总是空载体，请高手指点
已经有55人回复
- 关于感受态制备问题请教
已经有13人回复
- 大肠杆菌电转感受态细胞的制备中遇到的问题
已经有8人回复
- 急切求助感受态制备的问题，请高手指导
已经有3人回复
- 【求助/交流】请高手帮忙解决转化感受态细胞的问题
已经有8人回复
- 【求助/交流】请教一个制备感受态细胞中的问题
已经有10人回复
- 【求助】感受态细胞制备
已经有10人回复
- 【求助/交流】求助：PXO99感受态的制备和电转化
已经有5人回复
- 【求助/交流】关于制备感受态细胞的重悬问题
已经有5人回复
- 【求助/交流】请问本身有抗性的菌株制备感受态全程需要加抗性吗
已经有9人回复
iaminxanadu
木虫 (正式写手)
- MicEPI: 16
- 应助: 0 (幼儿园)
- 金币: 1473.3
- 散金: 1300
- 红花: 14
- 帖子: 631
- 在线: 429.6小时
- 虫号: 531438
- 注册: 2008-03-23
- 性别: GG
- 专业: 环境微生物学
2楼2011-11-18 14:09:33
匿名
用户注销 (著名写手)
- 应助: 17 (小学生)
- 金币: 1670.9
- 散金: 811
- 红花: 11
- 帖子: 1245
- 在线: 297.1小时
- 虫号: 0
- 注册: 2010-11-27
- 专业: 环境微生物学
3楼2011-11-18 20:17:15
shuwolf
新虫 (小有名气)
- 应助: 2 (幼儿园)
- 金币: 77.7
- 散金: 23
- 帖子: 117
- 在线: 24小时
- 虫号: 1183783
- 注册: 2011-01-05
- 性别: GG
- 专业: 植物保护生物技术
4楼2012-06-06 18:29:30
【答案】应助回帖
★ ★ ★
rainwander: 金币+3, 鼓励交流 2012-06-07 08:51:31
rainwander: 金币+3, 鼓励交流 2012-06-07 08:51:31
|
大肠杆菌的感受态应该是很容易做的，结合你的实验操作说说我自己的经验吧： 1、集菌的离心时间5000rpm 5min就够 2、转接之后的培养时间有些长，如果按照1:50的比例接，我一般培养2~3h就开始做感受态，感受态效果与菌的活力成正相关，不见得菌越多越好 3、CaCl2作用一次不如两次效果好，第二次重悬之后冰上孵育的时间可以尽量延长，几个小时都没有问题， 4、集菌之后的左右操作一定要保证在冰上，尽量缩短将菌体暴露于常温下 5、最后一步CaCl2重悬后，应该添加15~20%的甘油作为保护剂，然后分装保存于-80℃冰箱即可。50ml的菌，最后用5ml重悬都可以的。 |
5楼2012-06-07 07:02:42
6楼2012-08-14 20:19:30
zboter
银虫 (正式写手)
- 应助: 3 (幼儿园)
- 金币: 255.5
- 帖子: 372
- 在线: 107.5小时
- 虫号: 865716
- 注册: 2009-10-08
- 性别: GG
- 专业: 生物大分子结构与功能
7楼2012-08-14 22:24:32
yelangfh713
至尊木虫 (正式写手)
- 应助: 4 (幼儿园)
- 金币: 9681.1
- 散金: 100
- 红花: 1
- 帖子: 863
- 在线: 150.3小时
- 虫号: 479236
- 注册: 2007-12-14
- 性别: GG
- 专业: 微生物生理与生物化学
8楼2012-08-15 16:53:01
琼苑
铜虫 (初入文坛)
- 应助: 0 (幼儿园)
- 金币: 119.8
- 散金: 14
- 帖子: 34
- 在线: 28.4小时
- 虫号: 2039858
- 注册: 2012-10-01
- 性别: MM
- 专业: 微生物生态学
9楼2012-10-05 14:25:59
200
