| 查看: 2636 | 回复: 8 | |||
缘来是伊木虫 (小有名气)
|
[交流]
谁有做电转化时E.coli感受态细胞的制备的操作步骤的资料？求分享，谢谢！
|
| 由于电转化效率比较高，我的质粒比较大，想用电转化，谁有做电转化时E.coli感受态细胞的制备的操作步骤的资料？求分享，谢谢！ |
回复此楼» 猜你喜欢
朋友圈看到的
已经有9人回复
-
能否退出参与的面上项目解除限项
已经有13人回复
-
让我中一个面上吧！
已经有16人回复
-
放榜前的不淡定
已经有17人回复
-
科研孤儿太难了
已经有19人回复
-
明天应该可查了！？
已经有4人回复
-
什么时候开奖？
已经有11人回复
-
范进中举一文的中心思想
已经有6人回复
-
建议基金发布提前给出明确的时间点
已经有14人回复
-
2026国自然函评费到账
已经有17人回复
» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
- 感受态细胞制备
已经有8人回复
- DH5α感受态细胞和JM109的区别是什么？
已经有8人回复
- DB3.1高效感受态细胞制备问题
已经有4人回复
- 电转化DH5α感受态
已经有16人回复
- 请问制备的电转化的感受态细胞可以用于化学转化操作吗？
已经有3人回复
- TSS方法制备感受态细胞（楼主已测试过，非常实用）
已经有67人回复
- 毕赤酵母用于电转化制备感受态细胞步骤
已经有13人回复
- 感受态细胞的制备（DH5α大肠杆菌）
已经有73人回复
- 为什么要制备感受态细胞，制备感受态细胞的目的与意义是什么？
已经有3人回复
- 细胞培养时小牛血清等分装的时候用的离心管没有高压灭菌该怎么办？
已经有13人回复
- 感受态细胞转化后的存放问题
已经有8人回复
- 感受态细胞转化
已经有17人回复
- E.coli TOP10 从哪里买到？
已经有14人回复
- 大肠杆菌DH5α感受态制备
已经有21人回复
- 一个关于感受态转化效率的问题
已经有11人回复
- 感受态的制备及转化？
已经有13人回复
- 【求助/交流】在线等：E.coli BL21 转化子在kan平板上要长多久
已经有8人回复
- 【资料】超级感受态制备方法-英文版
已经有124人回复
- 【求助/交流】E.coli K-12
已经有7人回复
- 【求助/交流】求助：酵母感受态细胞的制备
已经有9人回复
- 【求助/交流】制备BL21(DE3)感受态细胞及质粒转化操作步骤
已经有9人回复
- 电转化注意事项
已经有14人回复
- 微生物学考研资料1(沈萍版同步）免币分享
已经有67人回复
2楼2015-05-14 19:23:32
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
|
用氯化钙制备和转化感受态大肠杆菌 大肠杆菌E.coli DH5a感受态细胞的制备参照《分子克隆实验指南》的方法进行 1. 缓冲液和溶液： ①CaCl2 •2H2O（1mol/L） 注：制备感受态细胞时，取出10ml贮存液加90ml纯水稀释至100ml，用预处理的Nalgene 滤膜（0.45um孔径）过滤除菌，放置冰上。 ② CaCl2-MgCl2溶液冰上预冷 2. 培养基 ①LB 液体LB培养基的配方如下: 胰蛋白胨(Tryptone) 10g/L；酵母提取物(Yeast extract) 5g/L；氯化钠(NaCl) 10g/L 摇动容器直至溶质溶解（或加热搅拌）.用5mol/L NaOH(约0.2ml)调节该培养基的pH,使其达到7.0(该pH适合目前使用最广的原核表达菌种E.coli的生长)，在15psi（1.05Kg/cm2=103kPa）,121.3℃蒸汽灭菌20min。 固体加15g琼脂粉（若不易溶解时，不断加热搅拌） 抗生素的加入：高压灭菌后，将融化的LB固体培养基置于55℃的水浴中，待培养基温度降到55℃时（手可触摸）加入抗生素，以免温度过高导致抗生素失效，并充分摇匀。 ②SOC 除加入20mmol/L葡萄糖外，其他成分与SOB培养基相同。SOB培养基经过高压灭菌后冷却至60℃或60℃以下，加20mL除菌的1mol/L葡萄糖溶液（1mol/L葡萄糖溶液的配制方法是：用90mL去离子水溶解18g葡萄糖，完全溶解后，用去离子水（蒸馏水）定容至100ml,用0.22um氯气过滤除菌）。 SOB培养基：配制每升培养基，在950ml去离子水（蒸馏水）中加入：胰化蛋白胨 20g，酵母提取物5g，NaCl 0.5g 摇动溶液是溶质完全溶解。加10ml 250mmol/L KCl溶液（将1.86gKCl用100mL去离子水溶解即配成250mmol/L的KCl溶液）。用5mol/L NaOH调节该培养基的pH,使其达到7.0。用去离子水定容至1L。在15psi高压下蒸汽灭菌20min。该溶液在使用前，加入5mL灭菌的2mol/L的MgCl2(90ml去离子水溶解19g MgCl2，用去离子水调整体积为100ml，在15psi高压下整齐灭菌20min) 3.实验过程 A：用接种环取少量细菌保存液接种，37℃培养16-20h B：取大肠杆菌DH5a单菌落，接种于5mL液体LB培养基中，于37℃振荡培养过夜 C：取0.5mL上述过夜培养物，按1：100的稀释比例倒入20mL LB液体培养基中37℃振荡培养3-4h。 注：为达到高的转化效率，活细胞数目务必小于108个/L，对大多数大肠杆菌来说，这相当于OD600值为0.4左右。为保证细菌培养物的生长密度不致过高，可每隔15-20min测定OD600来监控，用监控的时间及OD600值列一个图表，以便预测培养物的OD600值达到0.4的时间，当OD值达到0.35时，收获细菌培养物。 不同菌株的OD值与活菌数关系差异很大，因此有必要测定所用菌株的对应关系。以LB琼脂平板计算每一时刻的细菌活菌数，从而是分光光度计的读数标准化。 D：将培养液转移到预冷的50mL无菌离心管中，冰浴30min，使菌液冷却至0℃，于4℃4000r／min离心10min，弃上清液（培养液倒出后，将管倒置1min以使最后的痕量培养液流尽） D：每50ml初始培养液用30ml预冷的0.1mol/L CaCl2-MgCl2溶液（80mmol/L MgCl2,20 mmol/L CaCl2），即每支离心管沉淀中加入30mL冰浴的CaCl2-MgCl2溶液，重悬每份细胞沉淀。 E：于4℃ 4100r／min离心10min，弃上清液（培养液倒出后，将管倒置1min以使最后的痕量培养液流尽）以回收细胞 F：每50ml初始培养液用2ml预冷的0.1mol/L CaCl2溶液重悬每份细胞沉淀即每支离心管沉淀中加入2mL冰浴的CaCl2溶液。 G：分装后于液氮中迅速冷冻，置-70℃冰箱中，长期保存，也可立即使用 |
» 本帖已获得的红花（最新10朵）
缘来是伊3楼2015-05-15 09:58:46
缘来是伊
木虫 (小有名气)
- 应助: 0 (幼儿园)
- 金币: 1640.4
- 散金: 24
- 帖子: 51
- 在线: 75.8小时
- 虫号: 2151125
- 注册: 2012-11-27
- 性别: GG
- 专业: 环境微生物学
4楼2015-05-15 17:37:13
 |
5楼2015-05-15 18:07:50
 |
6楼2015-05-15 18:12:39
xiaochong8693
木虫之王 (文坛精英)
- 应助: 58 (初中生)
- 金币: 74370
- 散金: 3788
- 红花: 233
- 帖子: 47082
- 在线: 2659.9小时
- 虫号: 752823
- 注册: 2009-04-20
- 专业: 动物学
7楼2015-05-15 18:19:22
602059625
金虫 (知名作家)
- MicEPI: 1
- 应助: 4 (幼儿园)
- 金币: 1543.3
- 散金: 1236
- 红花: 59
- 沙发: 23
- 帖子: 7530
- 在线: 4557.6小时
- 虫号: 1025998
- 注册: 2010-05-22
- 性别: GG
- 专业: 地球内部物理学
8楼2015-05-17 22:08:32
shuaishuai90
银虫 (小有名气)
- 应助: 0 (幼儿园)
- 金币: 443.4
- 散金: 15
- 帖子: 176
- 在线: 30.3小时
- 虫号: 1151774
- 注册: 2010-11-20
- 性别: MM
- 专业: 天然药物化学
9楼2022-05-28 17:22:30
20