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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » SSR预实验荧光带不上
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xynlwt

新虫 (初入文坛)

[求助] SSR预实验荧光带不上 已有2人参与

如题，SSR的预实验已经做了很久，荧光基团总是加不到目的片段上，而是加在二聚体或者其他杂带上，20ul和10ul体系都能P出来，用的酶是天根的TAQ MIX，引物部分试过三种都失败了，其他水和DNA的比例问题不大。1），F引物：M13F引物：修饰基团：R引物=2：3：5：10。2），F引物：M13F引物：修饰基团：R引物=0.5:0.5:9:10。这种荧光加在目的片段上一点点，峰极低，几乎看不见。3），用了两轮，第一轮，M13F引物：R=1:1。第一轮产物用作第二轮模板，第二轮引物比例为，修饰基团：R引物=1:1。峰还是很低，要么就是依然加在比较短的杂带上。最后想看看正常情况到底应该什么样，就合了一条直接把修饰基团加在F引物上的引物，这次确实加到了目的片段上，但是这种方法太贵了，预实验的话会远超预算，只有预实验先做好了正式实验再用，所以请大神们帮我看看怎样能把这个预实验部分做出来，谢了！
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1楼 2015-05-11 10:30:11
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xynlwt

新虫 (初入文坛)
顶一下，给大神们看一看~
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2楼2015-05-11 15:05:53
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yingheqian

金虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+1, 鼓励交流 2015-05-12 08:03:47
xynlwt: 金币+1, ★有帮助 2015-05-12 14:17:31
这个效果肯定没有直接标记在引物上好，我们试过引物合成的时候合成长一点的引物，也就是一端（F或R)的引物在其5‘端加上M13引物，第一次PCR就用这个扩增，然后以扩增产物为模板，用荧光标记的M13引物和另一端没有标记的（R或F）引物，再扩增一次。效果还行。
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3楼2015-05-11 20:16:12
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吾小豆123

金虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+1, 鼓励交流 2015-05-12 08:03:52
xynlwt: 金币+10, ★★★很有帮助 2015-05-12 14:17:17
有篇文献是专门讲这个技术的。An economic method for the fluorescent labeling
of PCR fragments   可以适当调整引物的浓度。
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4楼2015-05-11 21:43:21
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xynlwt

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 吾小豆123 at 2015-05-11 21:43:21
有篇文献是专门讲这个技术的。An economic method for the fluorescent labeling
of PCR fragments   可以适当调整引物的浓度。

多谢我去看看哈~
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5楼2015-05-12 14:13:14
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xynlwt

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by yingheqian at 2015-05-11 20:16:12
这个效果肯定没有直接标记在引物上好，我们试过引物合成的时候合成长一点的引物，也就是一端（F或R)的引物在其5‘端加上M13引物，第一次PCR就用这个扩增，然后以扩增产物为模板，用荧光标记的M13引物和另一端没有标 ...

感谢您的回复~
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6楼2015-05-12 14:16:46
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