| 查看: 2811 | 回复: 13 | ||||
liuqinggc065新虫 (初入文坛)
|
[交流]
【求助/交流】荧光原位杂交实验技术 已有11人参与
|
|||
| 各位大侠，有谁做过荧光原位杂交的实验啊？本人最近要做这方面的实验，但没有做过。如果有哪位大侠做过，还请能把实验操作过程、注意事项等发来分享一下。有金币奖励哦！ |
回复此楼» 收录本帖的淘帖专辑推荐
 FISH&功能菌 |
» 猜你喜欢
留学--博士招生
已经有16人回复
-
化学工程，本211，求调剂，ab区不限
已经有4人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有120人回复
-
湖北师范大学招调剂啦
已经有9人回复
-
邵阳学院食品与化学工程学院硕士调剂
已经有0人回复
-
天津商业大学 生物与医药课题组招生
已经有0人回复
-
生物化工学硕招收调剂
已经有0人回复
-
广东石油化工学院2026年硕士研究生需要多名生物，制药工程，食品专业的调剂生
已经有0人回复
-
317分 一志愿江南大学 化学工程学硕 求调剂
已经有6人回复
-
化工申博
已经有3人回复
» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
- 去英国做几个月实验，想申请student visitor签证，邀请函上有internship字样
已经有3人回复
- 求救啊！请高手诊断病因所在，关乎实验生死.（免疫荧光技术）
已经有7人回复
- 【资料】LNA技术和原位杂交技术
已经有50人回复
- 转录组研究前沿
已经有21人回复
- 生物技术大实验实验指导书
已经有223人回复
- 求助——请懂荧光原位杂交的牛人解答一下
已经有4人回复
- 【求助/交流】请问原位杂交一般采用多少温度
已经有13人回复
- 聚焦显微镜
已经有3人回复
glidingwater
银虫 (小有名气)
- 应助: 0 (幼儿园)
- 金币: 348.5
- 帖子: 201
- 在线: 48.5小时
- 虫号: 905131
- 注册: 2009-11-17
- 性别: GG
- 专业: 微生物生理与生物化学
★ ★ ★ ★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
lstt09nk(金币+3):哇~~貌似很全的，是原创吗？ 2010-06-24 15:08:37
lstt09nk(金币+2):鼓励原创~~欢迎多多发布此类帖子，分享实验经验~~ 2010-06-24 15:13:09
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
lstt09nk(金币+3):哇~~貌似很全的，是原创吗？ 2010-06-24 15:08:37
lstt09nk(金币+2):鼓励原创~~欢迎多多发布此类帖子，分享实验经验~~ 2010-06-24 15:13:09
|
细菌细胞内核糖体数量达十万左右，核糖体RNA(rRNA)有特异区和高度保守区， 对物种的进化有指示性作用，被称为微生物体内的“活化石”。核糖体内的16S rRNA 的序列是最理想的用于基因分类的靶序列，进化过程相对独立、缓慢，其高度保守 区和高变区相间排列，从域（kingdom）到种都有特殊序列片段。 16S rRNA分子结 构上高度保守，只有某些位置有少量核苷酸序列的改变，而这些位置的改变具有种 属特异性。此外，该区信息较多，且长度适中，约1500 bp。所以根据16s rRNA序列的保守性和特异性可设计所需要的不同种属的寡核苷酸探针。所谓核酸探针是指能 识别特异核苷酸序列的带标记的一段单链DNA或RNA分子，只与被检测的特定核苷 酸序列结合，不与其他系列结合。FISH技术对微生物种群的探测使用的16(23)S rRNA寡核苷酸探针，一般荧光标记20 bp左右的特异性核苷酸片段上，利用该探针 与固定的组织或细胞中特定的核苷酸序列进行杂交。分子杂交先是DNA双链变性为 单链，然后同源单链在退火时，碱基重新互补配对形成双链结构的过程。FISH过程 并不需要DNA或RNA的提纯、扩增等繁琐步骤，实用性较强。 1)设计原则 寡核苷酸探针是根据已知靶序列设计的，遵循如下的设计原则：(1)探针长度： 10~50 bp，越短则特异性越差，太长则延长杂交时间；(2) G+C％应在40％~60％，否则降低特异性；(3)探针不要有内部互补序列，以免形成“发夹”结构。(4)避免同一 碱基连续重复出现；(5)与非靶序列区域同源性<70％。 2)获得探针序列 有三种方法获得探针序列，一是根据已知细菌种自主设计；二是直接利用已有 的寡核苷酸数据库，例如，Loy A.，Horn M.，Wanger M．等建立的 probeBase 寡核苷酸数据库，也可利用 NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)探针数据库。三是参 照文献上探针资料。 具体操作如下： 在接菌培养至相应时间 时，取 菌液三角瓶中矿浆培养液 1ml 于 1.5ml ependorf 管中，13500rpm 离心 10min，弃上清，分别加 500μl×PBS 震荡混匀，13500rpm 离心 10min，弃上清，加 50μl×PBS 和 150μl 4%多聚甲醛震荡混匀，冰上固定 3h。 固定完毕， 13500rpm 离心 10min，弃上清，分别加 500μl×PBS 震荡混匀，13500rpm 再离心 10min，弃上清，重复上述操作一次，然后分别加 50μl×PBS 和50μl 无水乙醇混匀，各取 5μl--10μl 样点到玻片上，剩余样品放入-20℃冷柜保存，留作后用。 加到玻片上的样品自然风干，然后用浓度为 50 %、80 %、98 %梯度乙醇各脱水3 min，自然风干。以此同时，在 50ml 的离心管中垫上一块餐巾纸或一小块棉纱，然后用杂交缓冲液把其润湿，放入 46℃的培养箱中预热 10min。 在自然风干的样品上点加杂交液，每个样加 9μl 杂交液，其中探针 1μl，杂交缓冲液 8μl。先按样品的数量计算总的探针的量和杂交缓冲液的量，然后分别取总的探针的量和杂交缓冲液的量于 PCR 管中混合均匀，再分别吸取 9μl 点到样品上。加完杂交液后，迅速把玻片放入事先预热好的离心管中，拧好盖子，放入 46℃的培养箱中，遮蔽光线，杂交 2.5h 到 3h。 杂交结束前 20min 左右，把洗脱液到人 50ml 的离心管中，固定在浮漂上，放 入 48℃的水浴锅中预热。待杂交结束，取出玻片，用 1ml 洗液器吸取预热的洗脱液 缓慢地把杂交液冲洗掉，然后把玻片放入预热好的洗脱离心管中，再放回 48℃的水 浴锅中洗脱 15min 左右，洗脱完后，用冷的去离子水缓慢冲洗玻片，避光自然风干， 荧光显微观察。如不能及时做荧光显微观察，可以把玻片保存在-20℃冰柜中。 个人能力有限，仅供参考，若有误，请指教！ [ Last edited by glidingwater on 2010-6-24 at 20:31 ] |
7楼2010-06-24 15:06:25
amilie030312
金虫 (正式写手)
- MolEPI: 2
- 应助: 7 (幼儿园)
- 金币: 644.8
- 帖子: 407
- 在线: 47.3小时
- 虫号: 296900
- 注册: 2006-11-18
- 专业: 动物遗传学
2楼2010-06-23 11:04:44
liuqinggc065
新虫 (初入文坛)
- 应助: 0 (幼儿园)
- 金币: 401
- 散金: 80
- 帖子: 25
- 在线: 8.4小时
- 虫号: 1030562
- 注册: 2010-05-28
- 性别: GG
- 专业: 农业昆虫学
3楼2010-06-24 09:03:16
lmzxcom1
金虫 (著名写手)
- 应助: 8 (幼儿园)
- 贵宾: 0.016
- 金币: 3353.8
- 散金: 1292
- 红花: 6
- 帖子: 1556
- 在线: 379小时
- 虫号: 584857
- 注册: 2008-08-01
- 性别: GG
- 专业: 生物化学
4楼2010-06-24 10:02:51
silicare
荣誉版主 (文坛精英)
合伙创业版兼职版主
- MolEPI: 1
- 应助: 88 (初中生)
- 贵宾: 29.823
- 金币: 18946.3
- 散金: 24272
- 红花: 300
- 沙发: 88
- 帖子: 10222
- 在线: 1602.6小时
- 虫号: 948825
- 注册: 2010-01-26
- 专业: 摩尼教
- 管辖: 新药研发
5楼2010-06-24 10:10:53
6楼2010-06-24 10:30:31
dingkui
铁杆木虫 (职业作家)
- 应助: 4 (幼儿园)
- 金币: 9118.6
- 散金: 1372
- 红花: 1
- 沙发: 1
- 帖子: 3190
- 在线: 497.3小时
- 虫号: 807999
- 注册: 2009-07-13
- 性别: GG
- 专业: 发育生物学
8楼2010-06-24 18:10:33
liuqinggc065
新虫 (初入文坛)
- 应助: 0 (幼儿园)
- 金币: 401
- 散金: 80
- 帖子: 25
- 在线: 8.4小时
- 虫号: 1030562
- 注册: 2010-05-28
- 性别: GG
- 专业: 农业昆虫学
9楼2010-06-24 21:38:59
liuqinggc065
新虫 (初入文坛)
- 应助: 0 (幼儿园)
- 金币: 401
- 散金: 80
- 帖子: 25
- 在线: 8.4小时
- 虫号: 1030562
- 注册: 2010-05-28
- 性别: GG
- 专业: 农业昆虫学
10楼2010-06-24 21:41:11
