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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 一个质粒能同时有两个复制原点吗
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busen

铁虫 (初入文坛)

[求助] 一个质粒能同时有两个复制原点吗 已有2人参与

最近通过PCR扩增了PET-28a载体的“pBR322复制原点和Kana R抗性基因” （注意并不是外源基因，而是复制原点！！），想对片段测序，该连到什么载体上呢？

之前将它连接到PMD 18T载体上（感受态TOP10)，没有成功。是不是因为T载和我的片段上同时存在两个复制原点的问题？
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1楼 2015-04-28 09:37:05
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lxj341401

至尊木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
busen: 金币+2, ★★★★★最佳答案 2015-04-28 15:37:13
直接PCR产物测序就是。
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2楼2015-04-28 10:56:59
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busen

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by lxj341401 at 2015-04-28 10:56:59
直接PCR产物测序就是。

PCR的时候在产物两端设计了PAC1的酶切位点，后期需要进行酶切、连接，直接酶切片段效果可能不如在载体上切效果好吧？
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3楼2015-04-28 11:21:42
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lxj341401

至尊木虫 (著名写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by busen at 2015-04-28 11:21:42
PCR的时候在产物两端设计了PAC1的酶切位点，后期需要进行酶切、连接，直接酶切片段效果可能不如在载体上切效果好吧？...

有保护碱基的话我们都是直接酶切，当然酶切效率要低于载体上，但基本的连接没问题。
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4楼2015-04-28 11:51:38
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nemo88

禁虫 (小有名气)
★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
busen: 金币+3, ★★★★★最佳答案 2015-04-28 15:36:57
本帖内容被屏蔽
5楼2015-04-28 13:51:19
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busen

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by lxj341401 at 2015-04-28 11:51:38
有保护碱基的话我们都是直接酶切，当然酶切效率要低于载体上，但基本的连接没问题。...

谢谢！！
引物直接拿文献上的用的，没有加保护碱基。保护碱基一般多长呢？
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6楼2015-04-28 14:34:21
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busen

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by nemo88 at 2015-04-28 13:51:19
二楼说滴对
PCR之后酶切比连载体后酶切效果其实要好，但要注意保护碱基
为什么说它好
因为载体上酶切的好坏还取决于你的片段与载体片段大小的比例
比如在3kb的载体上切下300bp的片段，那其实需要很大量的质粒才 ...

谢谢！！
那一般保护碱基设多长呢，有没有什么设计原则？
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7楼2015-04-28 14:36:09
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lxj341401

至尊木虫 (著名写手)
引用回帖:
6楼: Originally posted by busen at 2015-04-28 14:34:21
谢谢！！
引物直接拿文献上的用的，没有加保护碱基。保护碱基一般多长呢？...

网上有保护碱基表
http://wenku.baidu.com/link?url= ... TAvzWKLd4YERMKGTMVC
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8楼2015-04-28 14:37:29
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nemo88

禁虫 (小有名气)
本帖内容被屏蔽
9楼2015-04-28 14:54:46
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busen

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
9楼: Originally posted by nemo88 at 2015-04-28 14:54:46
可以参考保护碱基表，一般我就参照表格，然后加到6个（虽然有的写着只加1个就可以很高的效率）...

谢谢~~
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10楼2015-04-28 15:36:08
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