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busen

铁虫 (初入文坛)

[求助] 一个质粒能同时有两个复制原点吗 已有2人参与

最近通过PCR扩增了PET-28a载体的“pBR322复制原点和Kana R抗性基因” (注意并不是外源基因,而是复制原点!!),想对片段测序,该连到什么载体上呢?

之前将它连接到PMD 18T载体上(感受态TOP10),没有成功。是不是因为T载和我的片段上同时存在两个复制原点的问题?
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lxj341401

至尊木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
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busen: 金币+2, ★★★★★最佳答案 2015-04-28 15:37:13
直接PCR产物测序就是。
2楼2015-04-28 10:56:59
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busen

铁虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by lxj341401 at 2015-04-28 10:56:59
直接PCR产物测序就是。

PCR的时候在产物两端设计了PAC1的酶切位点,后期需要进行酶切、连接,直接酶切片段效果可能不如在载体上切效果好吧?
3楼2015-04-28 11:21:42
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lxj341401

至尊木虫 (著名写手)

引用回帖:
3楼: Originally posted by busen at 2015-04-28 11:21:42
PCR的时候在产物两端设计了PAC1的酶切位点,后期需要进行酶切、连接,直接酶切片段效果可能不如在载体上切效果好吧?...

有保护碱基的话我们都是直接酶切,当然酶切效率要低于载体上,但基本的连接没问题。
4楼2015-04-28 11:51:38
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nemo88

禁虫 (小有名气)

★ ★ ★
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busen: 金币+3, ★★★★★最佳答案 2015-04-28 15:36:57
本帖内容被屏蔽

5楼2015-04-28 13:51:19
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busen

铁虫 (初入文坛)

引用回帖:
4楼: Originally posted by lxj341401 at 2015-04-28 11:51:38
有保护碱基的话我们都是直接酶切,当然酶切效率要低于载体上,但基本的连接没问题。...

谢谢!!
引物直接拿文献上的用的,没有加保护碱基。保护碱基一般多长呢?
6楼2015-04-28 14:34:21
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busen

铁虫 (初入文坛)

引用回帖:
5楼: Originally posted by nemo88 at 2015-04-28 13:51:19
二楼说滴对
PCR之后酶切比连载体后酶切效果其实要好,但要注意保护碱基
为什么说它好
因为载体上酶切的好坏还取决于你的片段与载体片段大小的比例
比如在3kb的载体上切下300bp的片段,那其实需要很大量的质粒才 ...

谢谢!!
那一般保护碱基设多长呢,有没有什么设计原则?
7楼2015-04-28 14:36:09
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lxj341401

至尊木虫 (著名写手)

引用回帖:
6楼: Originally posted by busen at 2015-04-28 14:34:21
谢谢!!
引物直接拿文献上的用的,没有加保护碱基。保护碱基一般多长呢?...

网上有保护碱基表
http://wenku.baidu.com/link?url= ... TAvzWKLd4YERMKGTMVC
8楼2015-04-28 14:37:29
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nemo88

禁虫 (小有名气)

本帖内容被屏蔽

9楼2015-04-28 14:54:46
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busen

铁虫 (初入文坛)

引用回帖:
9楼: Originally posted by nemo88 at 2015-04-28 14:54:46
可以参考保护碱基表,一般我就参照表格,然后加到6个(虽然有的写着只加1个就可以很高的效率)...

谢谢~~
10楼2015-04-28 15:36:08
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