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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 蛋白/酶 » α-半乳糖苷酶的酶活测定
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liliman2005

新虫 (初入文坛)

[求助] α-半乳糖苷酶的酶活测定 已有1人参与

大家好，我最近做α-半乳糖苷酶的酶活测定，自己克隆的酶  验证有没有酶活，采用的方法是pNPG法，加入碳酸钠后不立即显色，而是过夜或好久才变黄色，是不是第五自己分解了，所以才变黄的，但是，我做了一个实验：
（1）酶+缓冲液+底物，反应30 分钟————碳酸钠终止液。。没有立即变黄，，过了一天  变黄，，时间变长颜色加深  说明底物在有光环境下自己分解了吗？？
（2）酶+缓冲液+底物，反应30 分钟————不加入碳酸钠终止液。。。过了好多天不变黄。。。。待（1）变黄后，按照推理，底物应该也分解，加入碳酸钠，却没有变黄？？为什么？？
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1楼 2015-04-09 17:17:33
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newslx

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

1）酶+缓冲液+底物，反应30 分钟————碳酸钠终止液。。没有立即变黄：不能以变没有变黄为标准，而是以在420 nm下的吸光值变化为标准，人眼的分辨率是有限的。如果吸光值没有显著变化，就说明酶活很低甚至没有活性。

过了一天  变黄，，时间变长颜色加深：那可能是因为碳酸钠本身有肉碱性，会催化pNGP分解。

（2）酶+缓冲液+底物，反应30 分钟————不加入碳酸钠终止液。。。过了好多天不变黄：那是因为对硝基酚需要在碱性条件下采用较大的吸光值。
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2楼2015-04-13 15:07:33
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