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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 综合其他 » 大肠杆菌中beta-半乳糖苷酶的困惑
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xiaoganghehe

铜虫 (著名写手)

[交流] 大肠杆菌中beta-半乳糖苷酶的困惑

小弟是学材料的，对微生物这块一窍不通，但老师要求我做微生物传感器，我也只能硬着头皮做了。
      最近有个想法，通过颜色的变化来反应金属离子的毒性。无意中看到有人用ONPG来检测beta-半乳糖苷酶的活性，并且文献上说对大肠杆菌而言beta-半乳糖苷酶是胞内酶。然后设想：金属离子能改变大肠杆菌细胞壁的通透性，通透性的改变能使细胞内的beta-半乳糖苷酶释放到细胞外。而beta-半乳糖苷酶可以催化水解ONPG，生成黄色的物质，该黄色物质在波长420nm处存在特征吸收峰。那么根据颜色的深浅及峰的强度就能判断出金属离子对大肠杆菌的毒性。
      为了使大肠杆菌产生beta-半乳糖苷酶，我在培养基中加入乳糖。培养后，用0.8%的NaCl溶液清洗离心分离，最后将细菌沉淀分散到PBS溶液中。但令人尴尬的是，即使在不存在金属离子的情况下，往菌液中加入ONPG，就可以观察到明显的黄色变化，并且在波长420nm处可以观察到水解产物的特征吸收峰。
     因此很困惑：beta-半乳糖苷酶是胞内酶还是胞外酶？是不是有的大肠杆菌中beta-半乳糖苷酶是胞内的，而有的则是胞外的？该如何理解胞内酶和胞外酶？
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1楼 2013-09-24 13:47:04
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547star

木虫 (著名写手)
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xiaoganghehe: 金币+2, 有帮助，谢谢这位虫友 2013-09-25 07:45:26
laozuzunzhe: 金币+1, 鼓励应助！ 2013-09-25 16:24:30
即使是胞内酶，底物可以进入细胞，被反应后，显色产物也可以从细胞出来。
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2楼2013-09-24 22:05:49
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liuyuexinfei

木虫 (著名写手)
★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
laozuzunzhe: 金币+1, 鼓励应助！ 2013-09-25 16:24:41
有道理，我们也做个这个实验，也发现了这个现象
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4楼2013-09-25 10:54:16
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xiaoganghehe

铜虫 (著名写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by liuyuexinfei at 2013-09-25 10:54:16
有道理，我们也做个这个实验，也发现了这个现象

是吗？！您能具体描述一下吗？
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5楼2013-09-25 11:04:52
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wmwnyxt

金虫 (小有名气)
★ ★ ★ ★
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laozuzunzhe: 金币+1, 鼓励应助！ 2013-09-25 16:24:52
xiaoganghehe: 金币+2 2013-09-25 19:51:47
大肠杆菌的一般都是胞内。
金属离子能改变大肠杆菌细胞壁的通透性，主要是改变其表观酶活，也就是使底物与产物更易进出细胞，与酶反应。
当然，也有少量的β-半乳糖苷酶会被释放到细胞外。
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6楼2013-09-25 16:21:28
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liuyuexinfei

木虫 (著名写手)
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xiaoganghehe: 金币+2 2013-09-26 09:35:53
引用回帖:
5楼: Originally posted by xiaoganghehe at 2013-09-25 11:04:52
是吗？！您能具体描述一下吗？...

我们也是使用ONPG测定B-半乳糖苷酶的活性，发现只要细菌中含有这个酶，加进去就会变色，并且这个酶的活性非常高，反应速率很快，其实这个酶是一个复合酶，很大的，B-半乳糖苷酶只是其中一部分，还有一部分是a-半乳糖苷酶。我们做的试验比较多，但是楼主的想法还是不错的，关键是怎么证明2楼的想法是关键
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7楼2013-09-26 09:19:40
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xiaoganghehe

铜虫 (著名写手)
引用回帖:
7楼: Originally posted by liuyuexinfei at 2013-09-26 09:19:40
我们也是使用ONPG测定B-半乳糖苷酶的活性，发现只要细菌中含有这个酶，加进去就会变色，并且这个酶的活性非常高，反应速率很快，其实这个酶是一个复合酶，很大的，B-半乳糖苷酶只是其中一部分，还有一部分是a-半乳 ...

我也看了一些相关的文献，B-半乳糖苷酶较大，一般不会透过细胞壁到细胞外。这几天想了一下，有可能是存在浓度梯度，ONPG会通过扩散进入细胞内部，并且也有文献佐证，因此2楼说的有道理。
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8楼2013-09-26 09:41:31
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mizhoulong

木虫 (著名写手)
★ ★ ★ ★
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xiaoganghehe: 金币+3 2013-09-26 15:38:26
关于这个问题，我回到了好几次了，

学过生化的都知道乳糖操纵子，可能仅仅是应付考试而已，学过就忘了。

beta-半乳糖苷酶实际上还需要另外两个酶组成beta-半乳糖苷酶转运体系。

这体系中有一个通透酶，可以将底物从胞外转运到胞内。

即使没有这个转运过程，一些现在未知的机制也可能是属于胞内酶同样表达出胞外酶的活性。

所以，你的改变膜通透性的思路是不合适的。

[ Last edited by mizhoulong on 2013-9-26 at 14:48 ]
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9楼2013-09-26 14:46:35
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xiaoganghehe

铜虫 (著名写手)
引用回帖:
9楼: Originally posted by mizhoulong at 2013-09-26 14:46:35
关于这个问题，我回到了好几次了，

学过生化的都知道乳糖操纵子，可能仅仅是应付考试而已，学过就忘了。

beta-半乳糖苷酶实际上还需要另外两个酶组成beta-半乳糖苷酶转运体系。

这体系中有一个通透酶，可 ...

请问那具体该怎么解释呢？从目前的结果看，我觉得只能是ONPG就入了细胞内部。我将培养液离心分离，取上清液，往其中滴加ONPG，没有观察到变黄。并且测吸收光谱，也没有观察到ONP的特征峰。
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10楼2013-09-26 15:41:25
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mizhoulong

木虫 (著名写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
你的这个离心，应该是高速离心吧？将细菌沉淀在管底，将可能存在的酶留在上清。

这个不足以解释beta-半乳糖苷酶是不是留在上清中，

因为酶活性的发挥，需要细胞内的环境。

不过，确实是ONPG进入细胞内才起的作用的。
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11楼2013-09-27 09:30:33
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huqinghua6335

木虫 (正式写手)
★
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引用回帖:
6楼: Originally posted by wmwnyxt at 2013-09-25 16:21:28
大肠杆菌的一般都是胞内。
金属离子能改变大肠杆菌细胞壁的通透性，主要是改变其表观酶活，也就是使底物与产物更易进出细胞，与酶反应。
当然，也有少量的β-半乳糖苷酶会被释放到细胞外。

你好 请问一下   是不是大肠杆菌就能产生半乳糖苷酶啊!  还是需要把半乳糖苷酶基因导进去才能产生？
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12楼2014-09-01 22:34:17
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huqinghua6335

木虫 (正式写手)
引用回帖:
7楼: Originally posted by liuyuexinfei at 2013-09-26 09:19:40
我们也是使用ONPG测定B-半乳糖苷酶的活性，发现只要细菌中含有这个酶，加进去就会变色，并且这个酶的活性非常高，反应速率很快，其实这个酶是一个复合酶，很大的，B-半乳糖苷酶只是其中一部分，还有一部分是a-半乳 ...

你好！ 请教您一个问题   是不是只要是大肠杆菌就能产生半乳糖苷酶啊！  还是需要基因转染
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13楼2014-09-01 22:35:27
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xiaoganghehe

铜虫 (著名写手)
引用回帖:
13楼: Originally posted by huqinghua6335 at 2014-09-01 22:35:27
你好！ 请教您一个问题   是不是只要是大肠杆菌就能产生半乳糖苷酶啊！  还是需要基因转染...

我不是学生物的，所以我也不太清楚，抱歉哈！
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14楼2014-09-02 08:02:09
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naoy

木虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
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7楼: Originally posted by liuyuexinfei at 2013-09-26 09:19:40
我们也是使用ONPG测定B-半乳糖苷酶的活性，发现只要细菌中含有这个酶，加进去就会变色，并且这个酶的活性非常高，反应速率很快，其实这个酶是一个复合酶，很大的，B-半乳糖苷酶只是其中一部分，还有一部分是a-半乳 ...

a-半乳糖苷酶是效价单位表示的。请问效价单位如何转化克.谢谢!
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15楼2015-03-28 08:14:45
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杨娟123456

新虫 (初入文坛)
★
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我也出现了你这个问题,你解决了吗?求解释.
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16楼2016-11-07 10:41:17
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杨娟123456

新虫 (初入文坛)
★
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4楼: Originally posted by liuyuexinfei at 2013-09-25 10:54:16
有道理，我们也做个这个实验，也发现了这个现象

你们是怎么解决的？
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17楼2016-11-07 11:44:40
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youxi23楼
2013-09-24 22:21   回复  
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