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liliman2005

新虫 (初入文坛)

[求助] α-半乳糖苷酶的酶活测定 已有1人参与

大家好,我最近做α-半乳糖苷酶的酶活测定,自己克隆的酶  验证有没有酶活,采用的方法是pNPG法,加入碳酸钠后不立即显色,而是过夜或好久才变黄色,是不是第五自己分解了,所以才变黄的,但是,我做了一个实验:
(1)酶+缓冲液+底物,反应30 分钟————碳酸钠终止液。。没有立即变黄,,过了一天  变黄,,时间变长颜色加深  说明底物在有光环境下自己分解了吗??
(2)酶+缓冲液+底物,反应30 分钟————不加入碳酸钠终止液。。。过了好多天不变黄。。。。待(1)变黄后,按照推理,底物应该也分解,加入碳酸钠,却没有变黄??为什么??
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newslx

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

1)酶+缓冲液+底物,反应30 分钟————碳酸钠终止液。。没有立即变黄:不能以变没有变黄为标准,而是以在420 nm下的吸光值变化为标准,人眼的分辨率是有限的。如果吸光值没有显著变化,就说明酶活很低甚至没有活性。

过了一天  变黄,,时间变长颜色加深:那可能是因为碳酸钠本身有肉碱性,会催化pNGP分解。

(2)酶+缓冲液+底物,反应30 分钟————不加入碳酸钠终止液。。。过了好多天不变黄:那是因为对硝基酚需要在碱性条件下采用较大的吸光值。
2楼2015-04-13 15:07:33
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