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280681193

银虫 (小有名气)

[求助] 易错pCR总是得不到我想要的条带,望大神给参考一下,看看哪里可以改进,谢谢 已有1人参与

目的基因Tc-GDH  846bp  质粒pMD18-T  2700bp
50微升体系
dNTP MIX     0.2mM
dGTP dCTP   0.4MM
Mncl2           0.2mM
IF  IR           0.4mM
Taq酶          2.5u
条件:
94               2min
94               30s
60               30s
68               45s
68               5min
20个循环

易错pCR总是得不到我想要的条带,望大神给参考一下,看看哪里可以改进,谢谢
TC-GDH.jpg
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水-水

新虫 (初入文坛)

体系很正常,Mn离子浓度也不高。1、主要调整Mg离子的浓度,Taq酶必须在有Mg离子的情况下才与模板结合,正确延伸。2、延伸温度应该选72℃。3、退火温度可以在Tm值-5℃的前提下,用温度梯度尝试一下,确定最合适的退火温度。
4楼2015-04-07 13:51:26
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查看全部 7 个回答

18761615793

木虫 (正式写手)

小虫

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2015-04-01 10:46:09
反应条件看起来很正常啊,还是进行镁离子 锰离子 和四中dNTP浓度的摸索吧,最佳条件总是经过多次摸索才得到的(如果模板太大可能也扩增不出来,你的这个貌似也还好)

» 本帖已获得的红花(最新10朵)

todayisdifficult,tomorrowismoredifficult,butthedayaftertomorrowisbeautiful
2楼2015-03-31 10:27:02
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280681193

银虫 (小有名气)

送红花一朵
引用回帖:
2楼: Originally posted by 18761615793 at 2015-03-31 10:27:02
反应条件看起来很正常啊,还是进行镁离子 锰离子 和四中dNTP浓度的摸索吧,最佳条件总是经过多次摸索才得到的(如果模板太大可能也扩增不出来,你的这个貌似也还好)

谢谢

[ 发自小木虫客户端 ]
3楼2015-04-01 09:54:56
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seraphlx

新虫 (初入文坛)

你好,我想问我在做易错PCR时加入锰离子,浓度跟你差不多,为什么扩出来的有沉淀析出,你遇到过么?谢谢
5楼2015-10-08 19:59:14
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