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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 易错pCR总是得不到我想要的条带，望大神给参考一下，看看哪里可以改进，谢谢
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280681193

银虫 (小有名气)

[求助] 易错pCR总是得不到我想要的条带，望大神给参考一下，看看哪里可以改进，谢谢 已有1人参与

目的基因Tc-GDH  846bp  质粒pMD18-T  2700bp
50微升体系
dNTP MIX     0.2mM
dGTP dCTP   0.4MM
Mncl2           0.2mM
IF  IR           0.4mM
Taq酶          2.5u
条件：
94               2min
94               30s
60               30s
68               45s
68               5min
20个循环

易错pCR总是得不到我想要的条带，望大神给参考一下，看看哪里可以改进，谢谢
TC-GDH.jpg
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1楼 2015-03-31 09:27:09
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280681193

银虫 (小有名气)
送红花一朵
引用回帖:
2楼: Originally posted by 18761615793 at 2015-03-31 10:27:02
反应条件看起来很正常啊，还是进行镁离子 锰离子 和四中dNTP浓度的摸索吧，最佳条件总是经过多次摸索才得到的（如果模板太大可能也扩增不出来，你的这个貌似也还好）

谢谢

[ 发自小木虫客户端 ]
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3楼2015-04-01 09:54:56
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18761615793

木虫 (正式写手)

小虫

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2015-04-01 10:46:09
反应条件看起来很正常啊，还是进行镁离子 锰离子 和四中dNTP浓度的摸索吧，最佳条件总是经过多次摸索才得到的（如果模板太大可能也扩增不出来，你的这个貌似也还好）
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280681193
todayisdifficult，tomorrowismoredifficult，butthedayaftertomorrowisbeautiful
2楼2015-03-31 10:27:02
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水-水

新虫 (初入文坛)
体系很正常，Mn离子浓度也不高。1、主要调整Mg离子的浓度,Taq酶必须在有Mg离子的情况下才与模板结合，正确延伸。2、延伸温度应该选72℃。3、退火温度可以在Tm值-5℃的前提下，用温度梯度尝试一下，确定最合适的退火温度。
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4楼2015-04-07 13:51:26
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seraphlx

新虫 (初入文坛)
你好，我想问我在做易错PCR时加入锰离子，浓度跟你差不多，为什么扩出来的有沉淀析出，你遇到过么？谢谢
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5楼2015-10-08 19:59:14
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