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[交流]
请问过柱子纯化之后，跑胶什么都没有啥原因 已有6人参与
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做了好几次了，都是纯化之后的什么都没有，但穿流液就有，我的表达量不是很明显，因为表达低的原因吗。 还有因为表达量不明显的原因，跑粗蛋白的时候能看到那条带，有时候又感觉看不到，所以我不是很确定我的表达出来了，因为实验室做不了western，但我感觉应该有。 没有表达原因大吗。还有什么别的原因吗 |
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 蛋白表达纯化与检测 |
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2楼2015-03-08 14:34:47
linxi8579
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3楼2015-03-08 21:58:53
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我也做这个，用的生工公司的柱子（ni柱） 1、穿透液有是正常的，但如果只有穿透液有，那就是挂柱子不好的原因了，挂的不好解决方法有（我是从木虫总结出来的） （1） 洗脱条件过于温和（组氨酸标签的蛋白质仍绑定）：通过咪唑梯度洗脱或降低pH值至最佳洗脱条件。 （2） 蛋白质沉淀或在柱中：尝试清洁剂或改变NaCl浓度或在变性（展开）条件（使用4-8尿素或4-6盐酸胍）洗脱，以除去沉淀的蛋白质。在接下来的实验中，减少样品的量，或减少蛋白质通过用线性梯度的咪唑代替浓度咪唑洗脱。 （3） 非特异性疏水性或其他相互作用：在洗脱缓冲液添加非离子洗涤剂（例如，0.2％的Triton X-100）或改变氯化钠浓度。 （4） 样品中和/或结合缓冲液的咪唑浓度太高：该蛋白质被包被于穿透液中。做实验时应减少样品和/结合缓冲液的咪唑浓度。 （5） 靶蛋白可能不是组氨酸标签如预期：确认DNA序列。分析诱导前的样品，例如，蛋白的Western印迹实验。 （6） 组氨酸标签可能不充分暴露：将蛋白质在发现流过的材料。在尿素或盐酸胍进行包涵体折叠蛋白纯化。 2、表达量低也是一个原因，因为纯化有损失，另外蛋白纯化时被高度稀释了，如果表达量太低，那后期纯化不明显。建议你先用超滤膜超滤浓缩一下再跑胶试试，如果不行，你可以再优化一下表达条件，表达量高了再做纯化（我是等不及了，要毕业了有木有，做不出来都是泪啊） 3、祝你成功，共勉吧，呜呜 |
4楼2015-03-09 08:40:54
5楼2015-03-09 17:56:14
6楼2015-03-12 15:48:56
12一笑而过
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7楼2015-03-12 16:05:17
匿名
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8楼2015-03-12 16:08:05
9楼2015-03-12 16:29:11
