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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 层析/纯化 » 请问过柱子纯化之后，跑胶什么都没有啥原因
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HX91926

铜虫 (小有名气)

[交流] 请问过柱子纯化之后，跑胶什么都没有啥原因 已有6人参与

做了好几次了，都是纯化之后的什么都没有，但穿流液就有，我的表达量不是很明显，因为表达低的原因吗。
还有因为表达量不明显的原因，跑粗蛋白的时候能看到那条带，有时候又感觉看不到，所以我不是很确定我的表达出来了，因为实验室做不了western，但我感觉应该有。
没有表达原因大吗。还有什么别的原因吗
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1楼 2015-03-08 12:10:44
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HX91926

铜虫 (小有名气)
有人不
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2楼2015-03-08 14:34:47
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linxi8579

铜虫 (正式写手)
★
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帮顶一下啊，我没有做过蛋白纯化，所以只是跟你探讨一下哈。你用什么纯化的啊，只是跑胶来看有没有蛋白有点不好说。因为你纯化后是特异的蛋白，过滤掉的是总蛋白。纯化后蛋白的量是很低的，所以即使纯化到了跑胶看不到也正常。这是积极的说法，也有可能没有表达，所以富集不到。不管怎么样，还是建议western blot来确定。另外，可以先用酶标仪测一下蛋白浓度
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3楼2015-03-08 21:58:53
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胡程

银虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
我也做这个，用的生工公司的柱子（ni柱）
1、穿透液有是正常的，但如果只有穿透液有，那就是挂柱子不好的原因了，挂的不好解决方法有（我是从木虫总结出来的）
（1）        洗脱条件过于温和（组氨酸标签的蛋白质仍绑定）：通过咪唑梯度洗脱或降低pH值至最佳洗脱条件。
（2）        蛋白质沉淀或在柱中：尝试清洁剂或改变NaCl浓度或在变性（展开）条件（使用4-8尿素或4-6盐酸胍）洗脱，以除去沉淀的蛋白质。在接下来的实验中，减少样品的量，或减少蛋白质通过用线性梯度的咪唑代替浓度咪唑洗脱。
（3）        非特异性疏水性或其他相互作用：在洗脱缓冲液添加非离子洗涤剂（例如，0.2％的Triton X-100）或改变氯化钠浓度。
（4）        样品中和/或结合缓冲液的咪唑浓度太高：该蛋白质被包被于穿透液中。做实验时应减少样品和/结合缓冲液的咪唑浓度。
（5）        靶蛋白可能不是组氨酸标签如预期：确认DNA序列。分析诱导前的样品，例如，蛋白的Western印迹实验。
（6）        组氨酸标签可能不充分暴露：将蛋白质在发现流过的材料。在尿素或盐酸胍进行包涵体折叠蛋白纯化。
2、表达量低也是一个原因，因为纯化有损失，另外蛋白纯化时被高度稀释了，如果表达量太低，那后期纯化不明显。建议你先用超滤膜超滤浓缩一下再跑胶试试，如果不行，你可以再优化一下表达条件，表达量高了再做纯化（我是等不及了，要毕业了有木有，做不出来都是泪啊）
3、祝你成功，共勉吧，呜呜
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做最好的自己
4楼2015-03-09 08:40:54
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HX91926

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 胡程 at 2015-03-09 08:40:54
我也做这个，用的生工公司的柱子（ni柱）
1、穿透液有是正常的，但如果只有穿透液有，那就是挂柱子不好的原因了，挂的不好解决方法有（我是从木虫总结出来的）
（1）        洗脱条件过于温和（组氨酸标签的蛋白质仍绑定 ...

恩恩，共勉
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5楼2015-03-09 17:56:14
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天际雾影

新虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
首先，你需要确定你的表达量是否合适，你可以减少诱导剂同时低温长时间诱导，看一下各种条件下诱导情况；其次，你将流穿液收集，同时将柱子用SDS-BUFFER煮5分钟，在同时跑电泳，看看柱子上是否有蛋白，如果有，就是你的洗脱buffer有问题；如果没有可能是由于你的结合或者破裂buffer与你的柱子不相容。你看看你的buffer里面是否含有SDS等去污剂或者EDTA等螯合剂。有的话你需要改变结合buffer的配方。
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6楼2015-03-12 15:48:56
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12一笑而过

金虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
你首先要确实你的目的蛋白是否表达出来了，然后再去上柱纯化，不然就是人力物力的浪费。如果是表达出来了，粗蛋白有带，纯化后没带，有两种可能：一是挂柱不好，大部分样品流穿，你可以将粗蛋白和流穿液同时跑胶看一下，看看目的条带的深浅，初步判断是根本没挂柱还是挂柱不好，然后改变挂柱条件再去摸索。纯化时样品被大量稀释，所以第二种可能是洗脱液的浓度太低，达不到电泳的最低要求，这样的话你可以把洗脱液浓缩一下再跑胶试试。祝好！
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科研之路很艰辛，但我会坚强的走下去的！给自己加油！
7楼2015-03-12 16:05:17
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匿名

荣誉版主 (知名作家)

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本帖仅楼主可见
8楼2015-03-12 16:08:05
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jxmomomo

新虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
做层析的孩纸们经常都会碰到这样的问题，也不要太灰心。。
看楼主用的是什么样的介质，确定目的蛋白肯定会在洗脱里面而不是穿透里面吗？
还有表达量低导致产物少，层析之后量就更少是很有可能的，所以跑电泳前可以先用超滤浓缩管浓缩（不过也可能损失一点蛋白）。。。
再就是如果确定粗蛋白电泳能看到目的条带的话，层析后的样品看不到条带可能是灵敏度不够，可以考虑用银染，毕竟它的分辨率传说中能达到ng级~

最后，祝好运啊！！同奋斗在生化实验道路上的人儿~
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求不只好好毕业~
9楼2015-03-12 16:29:11
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