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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 酵母双杂交AD载体构建
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faile18

金虫 (小有名气)

[求助] 酵母双杂交AD载体构建 已有4人参与

通过酵母双杂交筛选到互作蛋白，目前正在构建AD载体，其中photosystem I assembly protein Ycf4和TRAF transcription factor这两个基因，克隆测序后，酶切后与pGADT7连接，跑胶检测存在目的条带（连接应该没有问题），连接产物10ul转化全式金公司大肠杆菌感受态，冰浴40min；42°，60S；冰浴2.5min，SOC恢复培养1h，100ul涂氨苄抗性平板，过夜培养约14h，有克隆长出，而且存在大量类似于未涂均匀的菌落，菌液PCR检测无阳性克隆。重复几次怀疑是感受态有问题，又做了转化puc19和pGADT7的阳性对照，菌落生长情况与前面情况相同，请见图。目前怀疑抗生素有问题，烦请各位高手帮忙分析下可能存在的原因，感激，。

酵母双杂交AD载体构建
control.jpg


酵母双杂交AD载体构建-1
pGADT7.jpg


酵母双杂交AD载体构建-2
YCF4.jpg


酵母双杂交AD载体构建-3
TRAF.jpg
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1楼 2015-02-28 11:35:10
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WSM1993

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
faile18: 金币+2, ★有帮助 2015-02-28 12:19:20
应该就是抗生素的问题，也许你可以试一下双抗

[ 发自小木虫客户端 ]
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2楼2015-02-28 11:37:07
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faile18

金虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by WSM1993 at 2015-02-28 11:37:07
应该就是抗生素的问题，也许你可以试一下双抗

双抗？pGADT7只有氨苄抗性，双抗您指的是？
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3楼2015-02-28 12:19:09
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781055707

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
faile18: 金币+1, ★★★很有帮助 2015-03-01 09:56:42
培养皿无 抗性，这是肯定的了。。。。。。。。。。
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采菊东篱下，悠然见南山。
4楼2015-02-28 13:08:43
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starseacow

专家顾问 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
faile18(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2015-02-28 22:22:31
faile18: 金币+2, ★★★很有帮助 2015-03-01 09:56:02
氨苄抗性不足，你用的浓度是多少？我使用100mg/ml，有时候还加倍。另外氨苄容易降解失效，平板保存和使用时间都不宜过长

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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植物生理群69993869，为避免广告，申请加入请提供木虫昵称，院校及专业信息
5楼2015-02-28 16:39:16
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393658000

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
faile18: 金币+1, ★★★很有帮助 2015-03-01 09:56:31
新倒班吧  Amp没工作

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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6楼2015-03-01 09:05:08
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faile18

金虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 781055707 at 2015-02-28 13:08:43
培养皿无 抗性，这是肯定的了。。。。。。。。。。

昨天重新订的amp，确实是之前的失效了。
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7楼2015-03-01 09:54:56
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faile18

金虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by starseacow at 2015-02-28 16:39:16
氨苄抗性不足，你用的浓度是多少？我使用100mg/ml，有时候还加倍。另外氨苄容易降解失效，平板保存和使用时间都不宜过长

浓度是一样的，平板是新配的，今天的结果证实是氨苄失效了，
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8楼2015-03-01 09:55:52
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faile18

金虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by 393658000 at 2015-03-01 09:05:08
新倒班吧  Amp没工作

嗯，问题已经解决了，确实失效了
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9楼2015-03-01 09:56:20
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wang1991320

铜虫 (初入文坛)
我以前有过类似的情况，当时检查出来是新买的AMP的问题
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10楼2015-08-24 10:52:53
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