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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 蛋白/酶 » 土壤纤维素酶活测定
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猫猫狗狗222

新虫 (小有名气)

[求助] 土壤纤维素酶活测定 已有1人参与

我想做土壤纤维素酶活，但是做了好多次都不对，操作步骤在下方，请大家帮我看看哪里有错或者哪里需要改进，万分感谢！

缓冲液：0.2mol/L 醋酸溶液：11.55ml 95% 冰醋酸溶至1L. 
              0.2mol/L 醋酸钠溶液:1 6.4g C2H3O2Na或27.22g C2H3O2Na.3H2O溶至1L. 两者调节pH至4.5。
底物：准确称取0．625g羧甲基纤维素钠盐，溶于100ml醋酸钠缓冲溶液，加热搅拌使之溶解。
DNS：酒石酸钾钠18.2g，溶于50ml蒸馏水中，加热，于热溶液中依次加入3，5-二硝基水杨酸0.63g，NaOH2.1g，苯酚0.5g，无水亚硫酸钠0.5g ，搅拌至溶，冷却后用蒸馏水定容至100ml，贮于棕色瓶中，室温保存一周后使用。

取1g土壤，加入到10 mL无菌水，充分震荡(我做的是50度，震荡一小时)，制成稀释度为0．10的土壤溶液。各吸取上述制得土壤溶液4.5mL于5 mL的离心管中，8000 r/min，离心10 min。取离心后的土壤溶液2mL，置于具塞的试管中，在空试管中加入无菌水做为对照。样品置于50度水浴锅中预热2min，每个试管中加入1.5ml浓度为0.05mol/L，pH=4.5的醋酸钠缓冲液，分别加入4ml已预热至5O℃ 的底物溶液，对照组不加底物，以蒸馏水代替，50℃水浴中保温1 h后取出试管，立即加入1.5 mL DNS溶液以终止酶促反应，充分摇匀后沸水浴5min，取出冷却后用蒸馏水定容至25 mL。在540 nm波长下，用比色法测定溶液中的葡萄糖含量。

问题有以下几点：
1，DNS第一次配制未加亚硫酸钠，可以配置，没有沉淀。第二次加了亚硫酸钠有沉淀，放置5天仍未溶解。
2，文献里用的是10g土，加100ml水，我都减了十倍，但是浓度是一样的。也做过10g土100ml水的，结果和1g土的几乎没有差别。就本着节省的原则，用的是1g土，10ml水。
3，第一次对照组的DNS是在50度水浴后和实验组一起加的，第二次看有人说可以在水浴前就加，使反应不发生，就在水浴前加了。但是两次结果也没有差别。而且都出现个别对照组的数值比实验组还高。

标准曲线未做，目前测出的吸光值大概在0.01到0.02之间。

已经试验了很多次，花费了很多时间，仍未得到合适的结果， 希望您的帮助能解救我！
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1楼 2014-12-31 10:23:23
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暖小凉

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

DNS不是要放置一周左右才能使用么，是不是DNS没有配置好呀
赞一下 回复此楼
做自己喜欢做的事对得起大多数人
2楼2015-01-10 09:02:43
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