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nnxqwei至尊木虫 (职业作家)
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[求助]
求助酶的Kcat 计算！
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求助Kcat 计算！ 我用终浓度为100nM 纯酶（分子量440ＫDa）对一类底物进行动力学测定，比活力为68Ｕ/mg, 通过双曲线法得到底物的km值为0.2 mM, Vmax为40.22 mM/min，我用常用的公式计算酶对该底物的Kcat＝Vmax/[Ｅ]，结果好象不对！！！搞了好长时间，越来越糊涂了，请高手支招呀，谢谢！Kcat 应该得多少呢，应该如何计算呢？ [ Last edited by nnxqwei on 2013-7-3 at 15:30 ] |
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nnxqwei: 金币+10, ★★★很有帮助 2013-07-23 21:06:15
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以Lineweaver-Burk双倒数作图最常用，测定和计算简便，也比较准确。 将米-曼氏方程进行倒数处理，得下列方程： 以1/V0为纵坐标，1/[S]为横坐标作图可得一直线。纵轴截距为1/Vmax，斜率为Km/Vmax，横轴截距为-1/Km。举例 1/V = 240.5 + 577.2 x 1/[S] ， Vmax is 1/240.5 = 0.00416 ， Km = 0.00416 x 577.2 = 2.40 。 ” 100nM 纯酶（分子量440ＫDa）对一类底物进行动力学测定，比活力为68Ｕ/mg “，100nM*440000 (ng/L)=44000 000/1000 000 (mg/L)=44 （mg/L） ，计算得酶浓度时44mg/L 。 68U/mg*44mg/L=2992U/L=2.992u/ml ，计算得到比酶活是2.992u/ml，约3u/ml。不知道酶活是如何定义的，如果提供的信息、数据更多，更好确定。 |
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nnxqwei5楼2013-07-06 11:55:06
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nnxqwei: 金币+10, ★★★很有帮助, 很有参考意义! 2013-09-21 16:37:42
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Kcat是用Vmax算出来的，而Vmax显然是外推得到的。而米氏方程完成的条件是在测定过程中底物浓度变化不大，在底物浓度太低时，由于底物的量少，变化率可能较大加上系统的波动（导致不准）而底物浓度太高，速度太快，导致初速度测不准。这样就使得有效数据受两端数据影响很大。所以有时推出的Vmax显得匪夷所思，其实是很正常的。 楼主的计算没有问题，不过0.1uM的酶浓度可能偏高，估计测得的Vmax可能偏低。。kcat可以用s-1表示422200/60=7036.666667s-1。kcat/Km=3,5183,333.33M-1* S-1.应该在合理范围。 |
8楼2013-09-13 11:13:17
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