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[求助]
植物功能基因实验设计
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最近要做单子叶药用植物的功能基因，刚入门，还有很多不了解的，在此求教。 1、想一次克隆多个基因，是以随机引物Oligo（dT）逆转录cDNA，之后各自进行扩增；还是分别设计接头引物结合Oligo（dT）以mRNA为模板进行3’，5‘端的RACE。逆转录Promega的M-MLV逆转录酶10,000 U报价188，是否要自己订购Oligo（dT）Primer和dNTP和RAnase，GoScript逆转录系统报价699，宝生最近主页上不去，逆转录酶报价没找到。。。 2、利用简并引物法设计引物（用Codehop设计的，不知道选择的引物适不适合），结合巢式PCR，得到一段较保守的的序列，直接连接T载体。宝生的pMD18-T，报价500，Promega的pGEM-T报价350，查说pMD18转化率高，不用做蓝白斑筛选，酶切之后可以作为pUC使用（？）; pGEM-T据说效果也不错，不知道作为T载体使用之后能不能继续利用。 3、用RACE得到全长，查说3'端不需要试剂盒，5‘端比较困难。试剂盒用哪家的性价比高呢？ 4、得到全长之后，验证蛋白（酶）的功能，只需要转到酵母中去表达吧，是要分泌蛋白还是不分泌呢，这关系到载体的选择，目前还不太了解。 5、考虑之后要不要做发状根诱导转化目的基因进行功能验证，但是单子叶的诱导一般认为比较困难，目前我所知道的只有玉米（据说也有鸭跖草科的植物成功过），我想试一试，问隔壁实验室要了发根农杆菌C58c1，打算参照玉米的诱导条件试试，也想用其他的发状根农杆菌菌种诱导，但是觉得购买菌种不合算，老师不会赞成的，所以最好可以低价从虫友那里买几种，若有不吝赠送的当然更加感激！（如果有虫友觉得单子叶植物的发状根诱导毫无可能，也可以有理有据地泼泼冷水，我看是不是就不做了，只在其他模式植物里进行功能验证。） 本人在南京，问题较多，希望有虫友站短联系~ |
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