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霍烨zz银虫 (小有名气)
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肠道粘膜RNA提取总是降解，要崩溃了.....已有3人参与
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想要做肠道上皮细胞的转录组测序，做了两批试验，结果肠道粘膜的RNA样品都不合格 我把第二次的过程贴出来给大家看看，请指教到底有什么地方不合适： 1.样品制备：将小肠样品纵向剪开，在预冷过的生理盐水中漂洗几次，用滤纸小心吸干，于冰上平皿内刮取肠道粘膜，转移至1.5ml离心管中（提前加入0.5ml Trizol），直接放入-80冰箱保存； 2.RNA提取：样品管加入0.5mlTrizol，使trizol总体积为1ml，漩涡混匀（是粘膜样，就没有用液氮磨）。加入200ul氯仿，混匀后12000转离心15min 取上清，加入等体积异丙醇，混匀后-20℃放置20min；12000转离心15min；去掉上清，用75%的酒精（DEPC水配制）洗涤沉淀两次； RNA样品晾干至半透明，用DEPC水溶解后-80℃保存 3.电泳鉴定： 用的是1%琼脂糖+2ul golden view 3ul RNA + 3ul 2X RNA loading dye (65℃，变性10min） 然后120V，跑了20min，结果是这么个样子：（上样量5ul） Nanodrop结果：  RNA电泳图：  然后送公司鉴定的结果：  1是D-14，2是D-24 公司说条带比较模糊，弥散较多，说明已经降解了，不适合后续建库测序......  师姐给我分析，可能是刮粘膜的过程太费时间了，导致了降解，建议我可以直接取肠段提RNA 可是，我已经很小心了，一直都是在冰上操作的，漂洗的生理盐水也是4℃冰箱提前预冷过的，参考过很多文献，涉及肠道上皮细胞的，一般都是采取刮粘膜的方式，为什么别人就能做出RNA来，而我却不行啊？？？ 真诚地求教各位，我这该怎么办啊？？ RNA都提不好，后面就没法做了啊！！！  1.png |
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990104036
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