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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 核酸提取 » 肠道粘膜RNA提取总是降解，要崩溃了.....
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霍烨zz

银虫 (小有名气)

[求助] 肠道粘膜RNA提取总是降解，要崩溃了..... 已有3人参与

想要做肠道上皮细胞的转录组测序，做了两批试验，结果肠道粘膜的RNA样品都不合格
我把第二次的过程贴出来给大家看看，请指教到底有什么地方不合适：

1.样品制备：将小肠样品纵向剪开，在预冷过的生理盐水中漂洗几次，用滤纸小心吸干，于冰上平皿内刮取肠道粘膜，转移至1.5ml离心管中（提前加入0.5ml Trizol），直接放入-80冰箱保存；

2.RNA提取：样品管加入0.5mlTrizol，使trizol总体积为1ml，漩涡混匀（是粘膜样，就没有用液氮磨）。加入200ul氯仿，混匀后12000转离心15min
               取上清，加入等体积异丙醇，混匀后-20℃放置20min；12000转离心15min；去掉上清，用75%的酒精（DEPC水配制）洗涤沉淀两次；
                RNA样品晾干至半透明，用DEPC水溶解后-80℃保存

3.电泳鉴定： 用的是1%琼脂糖+2ul golden view
                                3ul RNA + 3ul 2X RNA loading dye (65℃，变性10min）
                                然后120V，跑了20min，结果是这么个样子：（上样量5ul）
Nanodrop结果：
肠道粘膜RNA提取总是降解，要崩溃了.....

RNA电泳图：
肠道粘膜RNA提取总是降解，要崩溃了.....-1

然后送公司鉴定的结果：
肠道粘膜RNA提取总是降解，要崩溃了.....-2
1是D-14，2是D-24
公司说条带比较模糊，弥散较多，说明已经降解了，不适合后续建库测序......



师姐给我分析，可能是刮粘膜的过程太费时间了，导致了降解，建议我可以直接取肠段提RNA
可是，我已经很小心了，一直都是在冰上操作的，漂洗的生理盐水也是4℃冰箱提前预冷过的，参考过很多文献，涉及肠道上皮细胞的，一般都是采取刮粘膜的方式，为什么别人就能做出RNA来，而我却不行啊？？？

真诚地求教各位，我这该怎么办啊？？
RNA都提不好，后面就没法做了啊！！！

肠道粘膜RNA提取总是降解，要崩溃了.....-3
1.png
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1楼 2014-12-07 15:30:05
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guoliwang

至尊木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
霍烨zz(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-12-07 19:39:22
霍烨zz: 金币+9, ★★★很有帮助 2014-12-07 23:02:24
建议你把肠黏膜组织直接冻存送公司，让他们自己提纯、鉴定，然后建库，也不会增加很多费用。RNA如果发生降解，解决起来很麻烦。提纯高质量RNA对专门做这个的公司来说就简单了。
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慎思明辨博学笃行
2楼2014-12-07 18:55:11
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霍烨zz

银虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by guoliwang at 2014-12-07 18:55:11
建议你把肠黏膜组织直接冻存送公司，让他们自己提纯、鉴定，然后建库，也不会增加很多费用。RNA如果发生降解，解决起来很麻烦。提纯高质量RNA对专门做这个的公司来说就简单了。

也直接送了肠粘膜的组织样，结果还是不行啊！

肠道粘膜RNA提取总是降解，要崩溃了.....-4

肠道粘膜RNA提取总是降解，要崩溃了.....-5

这是同一个批次的样品，感觉还没有我送RNA样的结果好.......



不知道是怎么回事，难道真的不能刮粘膜吗？
可是那么多的文献中都是刮粘膜，别人都还做出来了、
我是真的不知道该怎么改进了
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3楼2014-12-07 23:10:37
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990104036

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
霍烨zz: 金币+20, ★★★很有帮助, 谢谢！ 2015-01-22 10:38:24
你为何保存样品的时候就加入Trizol呢？我们实验室经常做肠道RNA。取样的时候按你说的方法洗干净(其实也没必要那么认真，很多时候都是直接取肠断，不刮粘膜)，取样后放入试管中冷冻。当开始做实验的时候，把样品磨成粉末状后与Trizol试剂。后面的过程都是那些就不说了。整个过程中切记，在离心完成后取上清液一定小心，别把沉淀物取上来。
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跟党走，有肉吃。
4楼2015-01-21 20:50:00
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霍烨zz

银虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 990104036 at 2015-01-21 20:50:00
你为何保存样品的时候就加入Trizol呢？我们实验室经常做肠道RNA。取样的时候按你说的方法洗干净(其实也没必要那么认真，很多时候都是直接取肠断，不刮粘膜)，取样后放入试管中冷冻。当开始做实验的时候，把样品磨成 ...

取样的时候就加trizol是听从了公司的建议，因为trizol中有RNA酶抑制剂，所以可能会好点
最近的一次取样，已经不刮粘膜了，直接用的肠段液氮速冻后-80保存；
也是直接送的肠段样品去公司，质检结果还没出来，希望一切顺利吧！
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5楼2015-01-22 10:41:23
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liubolin945

铁虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

我自身有点经验，因为刚开始做，感触不多，不知道能不能帮到你。
我在提取组织的时候发现用生理盐水清洗过的提取RNA质量都不高，不如直接液氮冻存。
买过一个RNA sample的试剂，还没用，是保存样品的，不让RNA降解，可以常温保存1个月，-20保存1年，效果还没试验不清楚，但是我估计是可以的。
不知道你的生理盐水是自己配置的还是买医疗器械的，我当时是药店买的，
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QQ：277046172
6楼2015-03-22 12:51:20
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萌面超人123

银虫 (小有名气)
请问楼主，你送冷冻样品是怎么运输的呀？用的干冰吗？
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7楼2016-10-03 09:53:48
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依旧安然

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 990104036 at 2015-01-21 20:50:00
你为何保存样品的时候就加入Trizol呢？我们实验室经常做肠道RNA。取样的时候按你说的方法洗干净(其实也没必要那么认真，很多时候都是直接取肠断，不刮粘膜)，取样后放入试管中冷冻。当开始做实验的时候，把样品磨成 ...

我也是最近开始提取小鼠盲肠前段上皮细胞的，因为小鼠太小了，刮取不到多少组织，请问大神我可不可以不刮取直接提取rna呢？（我的小鼠是20±2g的有用的部分还不到两个指节那么长的，实在刮取不下多少的组织）还有一定要用生理盐水冲洗吗？

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8楼2017-03-29 18:30:04
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徐小小悦

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 990104036 at 2015-01-21 20:50:00
你为何保存样品的时候就加入Trizol呢？我们实验室经常做肠道RNA。取样的时候按你说的方法洗干净(其实也没必要那么认真，很多时候都是直接取肠断，不刮粘膜)，取样后放入试管中冷冻。当开始做实验的时候，把样品磨成 ...

想问一下   一般取肠段要取多长？
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9楼2018-06-21 16:42:11
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