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miao2010

木虫 (正式写手)

[求助] 细菌的分子鉴定

各位虫友:
           大家好,本人在做细菌的分子鉴定时,出现了些故障。每次细菌DNA提取完后,进行PCR,再送出去测序,要测的片段是750bp左右,但测序结果始终从500bp以后都有双峰,我也改变了退火温度,但效果不明显。能确保是单一菌落提DNA,除了连梯载,还有什么办法吗?请各位指点指点,在此谢过了。
            PCR引物:1405f(5'-TGYACACACCGCCCGT-3')
                            456r(5'-CCTTT CCCTCACGGTACTG -3')
              程序:94度,5min
                         94度,1min
                         61度,1min
                         72度,90s
                         72度,10min

细菌的分子鉴定
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细菌的分子鉴定-1
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厚积薄发,天道酬勤
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miao2010

木虫 (正式写手)

引用回帖:
2楼: Originally posted by guoliwang at 2014-12-06 18:45:47
你PCR引物命名为什么大序号用f(forward),小序号用r(reverse)呢?
测序只用了正向引物么?可以用反向引物测序,应该500bp后面的信号会比较清楚。
如果想用单引物测通,可以提高PCR产物的浓度。比如增加PCR反应体积 ...

好的,谢谢。我做的双向测序,正反向都测,体积已经25微升了
厚积薄发,天道酬勤
3楼2014-12-09 11:58:37
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guoliwang

至尊木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
miao2010: 金币+45, 博学EPI+1 2014-12-09 11:55:20
你PCR引物命名为什么大序号用f(forward),小序号用r(reverse)呢?
测序只用了正向引物么?可以用反向引物测序,应该500bp后面的信号会比较清楚。
如果想用单引物测通,可以提高PCR产物的浓度。比如增加PCR反应体积或者增加一管PCR反应,产物浓缩后的体积不变。
慎思明辨博学笃行
2楼2014-12-06 18:45:47
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