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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 网络生活区 » 有奖问答 » 学术帮助 » 细菌的分子鉴定
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miao2010

木虫 (正式写手)

[求助] 细菌的分子鉴定

各位虫友:
           大家好，本人在做细菌的分子鉴定时，出现了些故障。每次细菌DNA提取完后，进行PCR，再送出去测序，要测的片段是750bp左右，但测序结果始终从500bp以后都有双峰，我也改变了退火温度，但效果不明显。能确保是单一菌落提DNA，除了连梯载，还有什么办法吗？请各位指点指点，在此谢过了。
            PCR引物：1405f（5'-TGYACACACCGCCCGT-3'）
                            456r（5'-CCTTT CCCTCACGGTACTG -3'）
              程序：94度，5min
                         94度，1min
                         61度，1min
                         72度，90s
                         72度，10min

细菌的分子鉴定
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细菌的分子鉴定-1
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厚积薄发，天道酬勤
1楼 2014-12-06 17:45:02
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guoliwang

至尊木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
miao2010: 金币+45, 博学EPI+1 2014-12-09 11:55:20
你PCR引物命名为什么大序号用f(forward)，小序号用r(reverse)呢？
测序只用了正向引物么？可以用反向引物测序，应该500bp后面的信号会比较清楚。
如果想用单引物测通，可以提高PCR产物的浓度。比如增加PCR反应体积或者增加一管PCR反应，产物浓缩后的体积不变。
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慎思明辨博学笃行
2楼2014-12-06 18:45:47
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miao2010

木虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by guoliwang at 2014-12-06 18:45:47
你PCR引物命名为什么大序号用f(forward)，小序号用r(reverse)呢？
测序只用了正向引物么？可以用反向引物测序，应该500bp后面的信号会比较清楚。
如果想用单引物测通，可以提高PCR产物的浓度。比如增加PCR反应体积 ...

好的，谢谢。我做的双向测序，正反向都测，体积已经25微升了
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厚积薄发，天道酬勤
3楼2014-12-09 11:58:37
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