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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 核酸杂交 » southern blot酶切基因组问题
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cnzpli

金虫 (正式写手)

[求助] southern blot酶切基因组问题 已有2人参与

如题，做southern blot时，在酶切基因组的时候应该用单切还是双酶切？看好多说单酶切，那么单酶切之后探针结合的条带大小为什么会和敲入的基因大小相同？单切应该不可能正好切下来目的片段的啊 ，切下来大小不一样跑的位置肯定不一样的啊。。。求解！
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1楼 2014-12-03 21:18:46
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cnzpli

金虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by ksws0465326 at 2014-12-03 22:02:03
做southern的话，我一般都选单酶切，先利用软件查找你要酶切坚定的片段上下游大概5k到10k bp的序列，然后从中确定要是用的霉，因为一个酶在目的基因或者目的基因其上下游都可能存在酶切位点，所以我的话一般都找目的 ...

我做的是转基因小鼠的鉴定 用的是小鼠基因组 无法确定整合位点 所以貌似你说的用不上。。。

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3楼2014-12-04 00:48:08
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ksws0465326

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
cnzpli(西门吹雪170代发): 金币+3, 鼓励热心回帖交流 2014-12-04 19:54:39
做southern的话，我一般都选单酶切，先利用软件查找你要酶切坚定的片段上下游大概5k到10k bp的序列，然后从中确定要是用的霉，因为一个酶在目的基因或者目的基因其上下游都可能存在酶切位点，所以我的话一般都找目的基因内没有酶切位点，而在其上下游附近都存在酶切位点的酶，两位点之间的碱基数也可知，假如为5000bp而目的基因片段为3000bp，则探针结合到酶切片段时因为此片段为5000bp所以结果显示为5000bp的条带。如果你找的单酶切在目的基因和其上下游均有位点，例如还是5000的片段，目的基因在其中的1500到4500，你选的酶在目的基因上的第500个碱基位置进行酶切，也就是说目的基因分为500，和2500，因此，此5000bp的片段就分为了2000bp和3000bp的条带，探针虽然是目的片段的全长，但还是可以结合到被切割为两段的片段上，所以检测出来就显示为2000和3000的条带了。不知道以上的讲解能否为楼主解惑。。。
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2楼2014-12-03 22:02:03
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shuangyin

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
cnzpli(西门吹雪170代发): 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-12-04 19:54:47
一般当然是单酶切，除非是特殊情况没有特别好的酶切位点采用双酶切。你这种不确定整合位点的肯定是一个酶就够了啊。选一个你转基因里面没有的酶切位点，选常用点的酶。这样一般条带都会大于你的转基因。如果不是的话，考虑检测下使用的酶有没有星活性产生
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4楼2014-12-04 14:21:05
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cnzpli

金虫 (正式写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by shuangyin at 2014-12-04 14:21:05
一般当然是单酶切，除非是特殊情况没有特别好的酶切位点采用双酶切。你这种不确定整合位点的肯定是一个酶就够了啊。选一个你转基因里面没有的酶切位点，选常用点的酶。这样一般条带都会大于你的转基因。如果不是的话 ...

检测到的条带必然大于我的基因，但是我怎么知道这个检测到的就是我的基因呢？因为和阳性对照大小不一样，发文章说我这个有问题啊。而且如果大小不一定的话要marker还有什么意义呢，只要有条带就行了啊

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5楼2014-12-04 14:28:15
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