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southern blot酶切基因组问题 已有2人参与
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| 如题，做southern blot时，在酶切基因组的时候应该用单切还是双酶切？看好多说单酶切，那么单酶切之后探针结合的条带大小为什么会和敲入的基因大小相同？单切应该不可能正好切下来目的片段的啊 ，切下来大小不一样跑的位置肯定不一样的啊。。。求解！ |
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ksws0465326
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【答案】应助回帖
★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
cnzpli(西门吹雪170代发): 金币+3, 鼓励热心回帖交流 2014-12-04 19:54:39
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cnzpli(西门吹雪170代发): 金币+3, 鼓励热心回帖交流 2014-12-04 19:54:39
做southern的话，我一般都选单酶切，先利用软件查找你要酶切坚定的片段上下游大概5k到10k bp的序列，然后从中确定要是用的霉，因为一个酶在目的基因或者目的基因其上下游都可能存在酶切位点，所以我的话一般都找目的基因内没有酶切位点，而在其上下游附近都存在酶切位点的酶，两位点之间的碱基数也可知，假如为5000bp而目的基因片段为3000bp，则探针结合到酶切片段时因为此片段为5000bp所以结果显示为5000bp的条带。如果你找的单酶切在目的基因和其上下游均有位点，例如还是5000的片段，目的基因在其中的1500到4500，你选的酶在目的基因上的第500个碱基位置进行酶切，也就是说目的基因分为500，和2500，因此，此5000bp的片段就分为了2000bp和3000bp的条带，探针虽然是目的片段的全长，但还是可以结合到被切割为两段的片段上，所以检测出来就显示为2000和3000的条带了。不知道以上的讲解能否为楼主解惑。。。 |
2楼2014-12-03 22:02:03
3楼2014-12-04 00:48:08
4楼2014-12-04 14:21:05
5楼2014-12-04 14:28:15
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我如果没理解错的话，你做的就是转基因在小鼠基因组中的随机整合，大小肯定是不确定的，除非你选的酶在你设计的质粒里面有两个酶切位点，这样不管整合在哪里大小都是一样，然而southern的酶切位点是不应该这么选的，质粒中顶多只能包含一个切割位点（当然这种情况你的目的条带是可能小于转基因大小的）。你做杂交的时候应该加一个质粒做对照，可以用合适的酶切质粒，你知道包含探针靶序列的片段大小，southern条带与预期吻合就可以验证探针没问题，那么你的样本条带就是可信的。 由于整合的随机性，一般不同位点目的条带不一，初步可以判断产生几个条带就说明发生了几个整合。当然也有可能不同整合的大小一样，这时就要做标准品，做灰度定量分析了。 |
6楼2014-12-05 15:15:04
7楼2014-12-22 10:02:02
