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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 实验/技术 » 怎样检测细菌中一个基因的表达量？想用定量检测！
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123n

木虫 (正式写手)

[求助] 怎样检测细菌中一个基因的表达量？想用定量检测！ 已有4人参与

怎样检测细菌中一个基因的表达量？想用定量检测，需要提取总RNA。直接用RNA做模板定量，还是把RNA反转录呢？
求大神支招！！！！！
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1楼 2014-11-21 10:22:53
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yuguiyan

至尊木虫 (文坛精英)
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2楼2014-11-21 10:26:45
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123n

木虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by yuguiyan at 2014-11-21 10:26:45
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我想做乳酸菌的基因定量，用什么内参呢？
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3楼2014-11-21 10:38:09
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yuguiyan

至尊木虫 (文坛精英)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
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3楼: Originally posted by 123n at 2014-11-21 10:38:09
我想做乳酸菌的基因定量，用什么内参呢？...

是贝塔－actin吗？我没做过你这个

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4楼2014-11-21 10:39:56
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123n

木虫 (正式写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by yuguiyan at 2014-11-21 10:39:56
是贝塔－actin吗？我没做过你这个
...

贝塔－actin 只有真核细胞有，亲~
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5楼2014-11-21 10:43:14
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yuguiyan

至尊木虫 (文坛精英)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 123n at 2014-11-21 10:43:14
贝塔－actin 只有真核细胞有，亲~...

酱紫啊，偶只做过真核嘿嘿

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6楼2014-11-21 10:45:14
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wanglei512

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
细菌最好做绝对定量 ，设计特异性引物，扩增基因上的特异性片段（50-500bp），连接T载体（其它载体也可以），测序正确后，作为标准质粒，构建标准曲线，来做绝对定量。有些是拿16SrRNA基因保守区作为内参，做相对定量。细菌可以直接用基因组DNA，也可以反转录后的cDNA，RNA是不能做模板的。
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7楼2014-11-21 20:58:41
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123n

木虫 (正式写手)
引用回帖:
7楼: Originally posted by wanglei512 at 2014-11-21 20:58:41
细菌最好做绝对定量 ，设计特异性引物，扩增基因上的特异性片段（50-500bp），连接T载体（其它载体也可以），测序正确后，作为标准质粒，构建标准曲线，来做绝对定量。有些是拿16SrRNA基因保守区作为内参，做相对定 ...

绝对定量也可以估计一个基因的表达量嘛？我用绝对定量测过一个基因的拷贝数！

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8楼2014-11-22 08:53:30
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wanglei512

金虫 (正式写手)
引用回帖:
8楼: Originally posted by 123n at 2014-11-22 08:53:30
绝对定量也可以估计一个基因的表达量嘛？我用绝对定量测过一个基因的拷贝数！
...

对于细菌，如果你要定量细菌的个数，可以用基因组DNA，如果要定量基因的表达量可以用CDNA。相对定量只是基因表达量相对内参基因的一个比值，是百分比，绝对定量是具体到拷贝数（根据标准曲线），有啥不可以。这里标准曲线和内参的作用不就是一样的吗，两种方法都是用pcr，都是用相同的引物，都是相同的模板，只是用不同的度量单位表示。
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9楼2014-11-22 12:54:46
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肥猫p

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
绝对定量求出来的是cDNA的拷贝数，也就相当于RNA的表达量啊。

相对定量，我觉得原核里面应该也有类似于真核actin的内参吧？
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10楼2014-11-23 22:12:06
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