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两个启动子强弱的比较 已有1人参与
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最近在做棉花的两个干旱启动子强弱的对比，分别是D7和DREB。我现阶段已经种下了80颗苗子，材料打算做子叶这一块，已经一周多了发芽率是90%。明后天就要进行干旱和盐处理了。自然干旱1h,3h,6,9h,12h,20h,24h,然后提取DNA和RNA，通过查阅文献是说将RNA反转录成cDNA，然后做半定量PCR；DNA然后做甲基化的对比。我不明白的是为什么要做半定量PCR,，而且甲基化这个我查阅文献说，甲基化越少，启动子就越强，可是及时你干旱处理了，不也还有其他因素可能导致甲基化吗？现在就是不敢做，苗子一直在长，就希望自己搞清楚了在做。有大神可以详细的解释一下吗？或者是有好的其他方法的对比吗？ |
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3楼2014-10-17 11:10:41
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现在也可以做RNA的甲基化定量检测，或者是DNA的定量检测。更多技术资料和问题，可以加技术Q：1951545998，其中RNA-----现货---m6A RNA甲基化定量检测试剂盒(比色法) (A-P-9005) m6A RNA甲基化定量检测试剂盒(比色法) 货号：A-P-9005 EpiQuik m6A RNA Methylation Quantification Kit (Colorimetric) 背景资料：N6-methyl-adenosine (m6A) is the most common and abundant modification in RNA molecules present in eukaryotes. The m6A modification is catalyzed by a methyltransferase complex METTL3 and removed by the recently discovered m6A RNA demethylases FTO and ALKBH5, which catalyze m6A demethylation in an α-ketoglutarate (α-KG)- and Fe2+-dependent manner. It was shown that METTL3, FTO, and ALKBH5 play important roles in many biological processes, ranging from development and metabolism to fertility. m6A accounts for more than 80% of all RNA base methylations and exists in various species. m6A is mainly distributed in mRNA and also occurs in non-coding RNA such as tRNA, rRNA, and snRNA. The relative abundance of m6A in mRNA transcripts has been shown to affect RNA metabolism processes such as splicing, nuclear export, translation ability and stability, and RNA transcription. Abnormal m6A methylation levels induced by defects in m6A RNA methylase and demethylase could lead to dysfunction of RNA and diseases. For example, abnormally low levels of m6A in target mRNAs due to increased FTO activity in patients with FTO mutations, through an as-yet undefined pathway, contributes to the onset of obesity and related diseases. The dynamic and reversible chemical m6A modification in RNA may also serve as a novel epigenetic marker of profound biological significance. Therefore, more useful information for a better understanding of m6A RNA methylation levels and distribution on RNA transcripts could benefit diagnostics and therapeutics of disease. 产品描述：In this assay, total RNA is bound to strip wells using a RNA high binding solution. m6A is detected using specific capture and detection antibodies. The detected signal is enhanced and then quantified colorimetrically by reading the absorbance in a microplate spectrophotometer at a wavelength of 450 nm. The amount of m6A is proportional to the OD intensity measured. Both negative and positive RNA controls are provided in this kit. A standard curve can be performed (range: 0.02 to 1 ng of m6A) or a single quantity of m6A can be used as a positive control. Because m6A content can vary from tissue to tissue, and from normal and diseased states, or vary under treated and untreated conditions, it is advised to run replicate samples to ensure that the signal generated is validated. This kit will allow the user to quantify an absolute amount of m6A and determine the relative m6A RNA methylation states of two different RNA samples。 详情：http://www.aderr.com/cn/main.php ... 07&id=32689 现货---RNA甲基化修饰试剂盒 (A-P-9003) RNA甲基化修饰试剂盒 货号：A-P-9003 Methylamp RNA Bisulfite Conversion Kit 背景资料：5-methylcytosine (5-mC) in DNA been well studied and is generally associated with repression of gene expression, but it has also been observed that in humans, 5-mC occurs in various RNA molecules including tRNAs, rRNAs, mRNAs, and non-coding RNAs (ncRNAs). At least 10,275 5-mC candidate sites were discovered in mRNAs and ncRNAs, which covered 10.6% of the total cytosine residues in the transcriptome. 5-mC seems to be enriched in some classes of ncRNA, but relatively depleted in mRNAs. However, the majority (83%) of their candidate sites were found in mRNAs. Within these transcripts, 5-mC appears to be depleted within protein coding sequences but enriched in 5’ and 3’ UTRs. Two different methyltransferases, NSUN2 and DNMT2 are known to catalyze the 5-mC modification in eukaryotic RNAs. Recent data strongly suggest that RNA cytosine methylation affects the regulation of various biological processes such as RNA stability and mRNA translation. Furthermore, loss of 5-mC in vault RNAs causes aberrant processing into Argonaute-associated small RNA fragments that can function as microRNAs. Thus, impaired processing of vault ncRNA may contribute to the etiology of human disorders related to NSUN2-deficiency human disorders. Bisulfite conversion of RNA, followed by RT-PCR amplification, cloning, and sequencing yields reliable information about RNA cytosine methylation states. By treating RNA with bisulfite, cytosine residues are deaminated to uracil while leaving 5-methylcytosine intact. 产品描述：The Methylamp RNA Bisulfite Conversion Kit contains all reagents required for fast and efificient bisulfite conversion on a RNA sample. A unique conversion mix solution contains powerful RNA protection reagents to prevent chemical and thermophilic degradation, thus leading to an accelerated conversion of all cytosines to uracil with negligible methylcytosine deamination. The non-toxic RNA capture solution enables RNA to tightly bind to the column filter, so that converted RNA cleaning can be carried out on the column to effectively remove residual bisulfite and salts。 详情：http://www.aderr.com/cn/main.php ... 07&id=32688 至于DNA的甲基化，选择也是比较多！ DNA甲基化定量试剂盒(比色法) 货号：A－P-1034 MethylFlash Methylated DNA Quantification Kit (Colorimetric) 背景资料：DNA甲基化定量试剂盒(比色法)提供了最优化的缓冲液和试剂，运用比色度的方法，通过检测微孔板上5-mC的水平，以定量检测全基因组的DNA甲基化水平。本试剂盒与MethylFlash DNA羟甲基化定量试剂盒(比色法)完美配合，同时定量检测DNA的甲基化和羟甲基化水平。 DNA甲基化定量试剂盒(比色法)是我们以前的Methylamp全基因组DNA 甲基化定量试剂盒的改进版，简化了工作流程，去掉了平板干燥和阻断两个步骤，提高了结果的稳定性。本试剂盒使用了一种新的方法把背景信号降到最低，去掉了平板干燥和阻断两个步骤。与基于套色板的方法相比(比如HPLC或者质谱)，本产品检测5-mC更加划算和精确。试剂盒有以下优点和特征： 方便快捷的比色法，易操作，完成整个实验不超过4小时 试剂盒中的新成分将背景信号降至最低，不对平板进行模块化，分析操作更简单，结果更精确可靠，也更稳定。 高灵敏度，检测极限为0·2 ng的甲基化DNA。 优化的抗体和加强溶液，能高度特异的识别5-mC，而不会与未甲基化的胞嘧啶结合，在特定浓度的DNA样品中几乎不会结合羟甲基化的胞嘧啶。 试剂盒中有普遍适用的阳性对照和阴性对照。 96孔板模式让您可以根据自己的需要地选择用手工或者高通量。 产品描述：MethylFlash甲基化DNA定量试剂盒(比色法)中含有定量检测全基因组甲基化所必需的所有试剂。在检测实验中，DNA被固定在一种有DNA吸附能力的孔上，甲基化的片段会被捕获剂以及检测抗体识别，用分光光度计读取微孔板在450nm处的比色度定量。甲基化的DNA的量与OD值成线性关系，可以通过本试剂盒提供的方程来计算两种不同的甲基化DNA样品的相对甲基化状态或者通过标准曲线完全定量5-mc。该DNA甲基化定量试剂盒(比色法)内主要产品组份包括：ME1 (10X Wash Buffer) ME2 (Binding Solution) ME3 (Negative Control, 20 ug/ml) ME4 (Positive Control, 20 ug/ml) ME5 (Capture Antibody, 1000 ug/ml ME6 (Detection Antibody, 400 ug/ml) ME7 (Enhancer Solution) ME8 (Developer Solution) ME9 (Stop Solution) 8-Well Assay Strips (With Frame) 用户指南手册 产品特点： 1、整个比色法检测实验的操作简单易学，方便快捷，只需要4小时就能完成实验。96孔板模式让您可以根据自己的需要地选择用手工或者高通量。 2、试剂盒提供通用阳性和阴性对照，能用于定量检测各种来源的DNA样品中的甲基化状态，包括哺乳动物、植物、真菌、细菌以及病毒； 3、试剂盒中含有定量检测全基因组DNA甲基化实验所有用到的试剂，包括阳性和阴性对照； 4、直接测定比色度的方法来进行定量检测取代了已过时的和劣质的方法，无须DNA消化/变性、提取、色谱分析等步骤，不接触放射性材料； 5、试剂盒采用了新方法和专利试剂使得甲基化DNA定量实验结果精确、高度灵敏特异，检测极限为0.2 ng的甲基化DNA。 链接：http://www.aderr.com/cn/main.php ... 07&id=20417 DNA甲基化修饰试剂盒： BisulFlash DNA甲基化极速修饰试剂盒 - 货号：A-P-1026 BisulFlash DNA Modification Kit 背景资料：BisulFlash DNA修饰试剂盒提供了最优化的缓冲液配方和试剂，利用EPI研制的新一代DNA亚硫酸氢盐转化技术，来对DNA进行修饰。利用本公司独创的化合物将DNA变性的同时进行亚硫酸氢盐转化操作。整个操作过程的时间被缩短到30分钟。并且，本试剂盒减少了90%的DNA损失，把样品中所有的胞嘧啶转换成尿嘧啶。传统方法在亚硫酸氢钠DNA转换步骤之前要单独的变性步骤，而BisulFlash技术中，DNA在整个亚硫酸氢钠转换过程中一直是维持在变性状态的。这个创造性的突破使本技术处理过程比其它试剂盒更加快速高效也更精确。我们在此基础上继续创新，鉴别了亚硫酸氢钠转换实验中关键性的四个组分，创造了新型的BisulFlash试剂盒。 产品描述:作为新一代的亚硫酸氢盐转换工具，BisulFlash DNA修饰试剂盒提供了最优化的缓冲液配方和试剂，能对DNA样品进行超快速的亚硫酸氢盐转换处理。利用试剂盒中即时可用的转换混合溶液，能在整个实验中一直维持DNA的变性状态。作为本公司的专利溶液，它能使亚硫酸氢钠快速地地所有胞嘧啶转换为尿嘧啶。混合溶液中含本公司特有的DNA保护剂，能阻止亚硫酸氢盐处理过程中DNA的化学和热降解。无毒的已修饰DNA俘获缓冲液能将DNA牢牢的结合在柱子的滤膜上，这样就能放心地洗涤DNA上的亚硫酸氢钠和盐离子。被修饰的DNA随后可以被洗脱下来，储存在-20℃两个月以上。该BisulFlash DNA甲基化修饰试剂盒内主要产品组份包括：BF1 (conversion mix solution) BF2 (capture solution) BF3 (desulfonation solution) BF4 (elution solution) BF5 (conversion enhancer) BF6 (denaturation enhancer) F-spin columns F-collection tubes 用户指南手册 产品特点： 1·快速的结果：只需要三十分钟，就能把您的DNA样品全部转换成纯化的亚硫酸氢盐修饰的DNA。这比时下其它同类试剂盒(2-8小时)或者原始方法(大于16小时)快得多。BisulFlash试剂盒中提供了所有亚硫酸氢盐转化实验和DNA洗涤所需的试剂，将时间减至最短步骤最少； 2·臻于完美的DNA转换效果：试剂盒每次转换反应可以转换0·2 ng – 1 ug 的 DNA。为了达到最优的转换效果，最好是限制在200-500 ng的范围。运用创新的方法和即时可用的专利DNA转换混合溶液使得转换反应可以在DNA变性的状态下进行，能将所有的胞嘧啶转换成尿嘧啶(>99·999%)，而5-甲基胞嘧啶则不受影响。实时PCR扩增被转换的DNA获得的低CT值证明了这种高效率(图·2)。完美的转换效率可以为随后的分析提供可靠和可重复的保障，是市场上其它同类试剂盒无法达到的。 3·强大的DNA保护：转换混合液中添加了DNA保护剂，可以阻止亚硫酸氢盐处理和变性过程中DNA的化学和热降解，使DNA一直处在稳定的变性状态，维持单链结构，为转换所有的胞嘧啶提供条件。阻止DNA降解使我们能够进行随后的扩增反应和分析大PCR片段。结合高效的DNA洗涤溶液和洗脱缓冲液，获得的转换DNA经长期储存(>6个月)和多次冻融不影响其质量。有效地避免了亚硫酸氢盐转化过程中90%的DNA被降解，从而获得更高更好的转化率。 4·极强的灵敏性：最低只需0.2ng或50个细胞的DNA样本即可实验甲基化。与我们的快速MS-qPCR试剂盒（A-P-1028）配套使用可以进行qMSP检测，实验结果更为精确可信，大大降低了实验过程中的假阳性概率。 5·简单、可信、实验条件始终如一。 详情：http://www.aderr.com/cn/main.php ... dle\" border=\"0\"> |
2楼2014-10-17 09:45:51
