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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » PCR非常非常奇特的一个问题，寻高人解决菜鸟的困惑。
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sunnjjian

金虫 (小有名气)

[求助] PCR非常非常奇特的一个问题，寻高人解决菜鸟的困惑。 已有5人参与

各位大神，我最近在做亚克隆，设计了好几对引物，目的带为711bp, 而PCR产物为1300bp左右，于是送去测序发现一个奇特的现象，1300bp中的两小段正是我要的序列中的一部分，有一段还是反向互补的，除去这两段序列将其他序列NCBI blast啥玩意也不是。也找不到我引物序列，请高人指点这是咋回事啊。
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1楼 2014-09-24 20:14:17
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sunnjjian

金虫 (小有名气)
怎么木有人回答啊
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2楼2014-09-24 20:27:47
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494750284

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
的确很有意思。我是菜鸟，但是想问几个小问题
1、这两小段包不包含引物序列？
2、这两小段有多长，是不是基因组中的长重复序列？
3、模板的DNA还是cDNA？
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3楼2014-09-25 12:15:28
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学习分子生物

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
引用回帖:
3楼: Originally posted by 494750284 at 2014-09-25 12:15:28
的确很有意思。我是菜鸟，但是想问几个小问题
1、这两小段包不包含引物序列？
2、这两小段有多长，是不是基因组中的长重复序列？
3、模板的DNA还是cDNA？

会不会扩的是杂带呀

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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4楼2014-09-25 16:34:19
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yunshenglmm

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
根据我的经验，我认为你pcr的模板有问题，如果是用质粒做模板，我猜测你可能把基因连反了，可能把克隆质粒扩出来了
另外，PCR退火温度应尽量高一点，以防止非特异扩增
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5楼2014-09-25 22:57:08
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jian212

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
感觉是模板有问题。
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学习再学习，努力再努力。
6楼2014-09-26 10:21:34
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liuderong

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
测序仪测序的时候，序列开头的50bp左右是测不出来的，或者说开头那段测出来可信度很低，一般都省略掉。正常情况下引物是不会出现在测序结果里的，目前的测序仪一般都用“边合成边测序”的原理测序，引物在反应前就已经合成好了，根本测不出来。
目的片段长度是700多，实际扩增1300，这种情况一般都会认为引物特异性不好，不会送测序。测序结果出现的情况的确很奇特，要分析的话首先要看你做PCR用了什么模版，如果是质粒模版，那扩增到blast比不出的序列也不算异常，也有可能是模版本身就有问题，PCR出来的片段本来就是这样的。然后看看1300的片段里和你预想片段对应得上的两个片段是不是连在一起的，还有它们的长度有多长，匹配程度是不是100%等等。再就是看测序公司了，也有可能是测序公司搞错了。
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7楼2014-09-26 12:11:11
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