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sunnjjian金虫 (小有名气)
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PCR非常非常奇特的一个问题，寻高人解决菜鸟的困惑。 已有5人参与
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| 各位大神，我最近在做亚克隆，设计了好几对引物，目的带为711bp, 而PCR产物为1300bp左右，于是送去测序发现一个奇特的现象，1300bp中的两小段正是我要的序列中的一部分，有一段还是反向互补的，除去这两段序列将其他序列NCBI blast啥玩意也不是。也找不到我引物序列，请高人指点这是咋回事啊。 |
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【答案】应助回帖
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测序仪测序的时候，序列开头的50bp左右是测不出来的，或者说开头那段测出来可信度很低，一般都省略掉。正常情况下引物是不会出现在测序结果里的，目前的测序仪一般都用“边合成边测序”的原理测序，引物在反应前就已经合成好了，根本测不出来。 目的片段长度是700多，实际扩增1300，这种情况一般都会认为引物特异性不好，不会送测序。测序结果出现的情况的确很奇特，要分析的话首先要看你做PCR用了什么模版，如果是质粒模版，那扩增到blast比不出的序列也不算异常，也有可能是模版本身就有问题，PCR出来的片段本来就是这样的。然后看看1300的片段里和你预想片段对应得上的两个片段是不是连在一起的，还有它们的长度有多长，匹配程度是不是100%等等。再就是看测序公司了，也有可能是测序公司搞错了。 |
7楼2014-09-26 12:11:11