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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 转基因PCR检测，为啥有些带亮，有些不亮？
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yangyang1991

铁杆木虫 (著名写手)

[求助] 转基因PCR检测，为啥有些带亮，有些不亮？ 已有4人参与

之前加正反引物0.4没有后来加1的亮。是不是因为引物量少的原因？还是其他什么？
又或者是模板的原因？

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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1楼 2014-08-06 07:32:44
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yangyang1991

铁杆木虫 (著名写手)
求助！
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2楼2014-08-06 08:19:06
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songzuowei

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
yangyang1991(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-08-06 09:28:31
yangyang1991: 金币+1, ★有帮助 2014-08-06 14:36:07
引物加少的话确实影响条带的亮度 这个我做过实验
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3楼2014-08-06 08:42:36
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peak-chen

金虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
yangyang1991: 金币+1, ★有帮助, 用的就是20ul的体系，之前加0.4，这次加0.8，条带比之前亮，并且多出现几条带，但是很不明显！想问下，如何改进。。。 2014-08-06 14:41:12
20ul体系，，，上下游引物在0.8-1ul...可以混合管，，一起加，，，比较不会因为误差
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4楼2014-08-06 09:53:25
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wszl666

银虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
yangyang1991: 金币+2, ★★★很有帮助, 用的就是20ul的体系，之前加0.4，这次加0.8，条带比之前亮，并且多出现几条带，但是很不明显！想问下，如何改进。。。 2014-08-06 14:41:30
用基因组做PCR本身就有这个问题，另外转基因的拷贝数也会有影响
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基因敲除
5楼2014-08-06 10:45:13
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happydove

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-08-06 16:24:27
yangyang1991: 金币+2, ★★★很有帮助 2014-08-06 22:49:57
首先不太清楚你扩增的是否为外源基因，如果是，有一个原因可以解释。
拷贝数越高的，扩增的是不是会很亮呢。
你说的引物浓度问题，是同一批引物扩增同一个模板吗？
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6楼2014-08-06 16:04:11
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yangyang1991

铁杆木虫 (著名写手)
引用回帖:
6楼: Originally posted by happydove at 2014-08-06 16:04:11
首先不太清楚你扩增的是否为外源基因，如果是，有一个原因可以解释。
拷贝数越高的，扩增的是不是会很亮呢。
你说的引物浓度问题，是同一批引物扩增同一个模板吗？

我今天试了下，增加循环次数，扩增的亮度没有改变。是同一批引物扩增同一个模板，扩增的是之前转入的过表达的基因。很纠结，一直检测的数量不够，没法往下做。。。
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7楼2014-08-06 22:49:48
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happydove

新虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by yangyang1991 at 2014-08-06 22:49:48
我今天试了下，增加循环次数，扩增的亮度没有改变。是同一批引物扩增同一个模板，扩增的是之前转入的过表达的基因。很纠结，一直检测的数量不够，没法往下做。。。...

不清楚你扩增的目的是什么，模板是植物还是动物？“一直检测的数量不够”是什么意思？
循环数40个也最高了，你扩增多长，用的什么酶、延伸时间等问题考虑过吗？
引物好用吗  可否多设计几对比较一下
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8楼2014-08-07 15:04:44
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yangyang1991

铁杆木虫 (著名写手)
引用回帖:
8楼: Originally posted by happydove at 2014-08-07 15:04:44
不清楚你扩增的目的是什么，模板是植物还是动物？“一直检测的数量不够”是什么意思？
循环数40个也最高了，你扩增多长，用的什么酶、延伸时间等问题考虑过吗？
引物好用吗  可否多设计几对比较一下...

非常感谢您这么热心的帮我。

扩增的目的是为了检测转基因阳性，模板是植物的。其他问题都考虑过了，之前的师兄师姐都做过一年。

从这些方面我再试试吧。。。实在不行就用这几个去做剩下的试验。。
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9楼2014-08-07 17:12:08
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