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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 如何鉴定一种DNA样本中的不同样本类型所占百分比
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linzshit

银虫 (小有名气)

[求助] 如何鉴定一种DNA样本中的不同样本类型所占百分比 已有3人参与

现在遇到一个技术难点，举个例子就是我混合两种不同的质粒A和B，质粒之间只存在一个点的差别，我用定量的方式确定两种质粒的浓度，然后进行混合，混合方式为A/(A+B)=5%，这里的百分比是浓度比。现在问题来了，对于混合后的样本，我想鉴定它到底是不是按我预想的混合成5%了，有什么方法吗？希望大神能够解答，谢谢
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1楼 2014-07-28 14:25:08
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柠萌粉

铜虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
linzshit(myprayer代发): 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，分子生物期待你更多精彩。 2014-07-29 11:53:18
southern探针都比较长，单个碱基突变似乎不好做
可以试试看QPCR的方法，把突变点设置为3'最后一个碱基
A引物扩增B的 B引物扩增A的 看看能否达到区分效果（看ct值差别大不大。。）
如果质粒量比较足的话，还可以试试酶切。。
不是大神的路过
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3楼2014-07-28 18:34:46
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柠萌粉

铜虫 (正式写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by linzshit at 2014-07-29 09:27:13
我的模板是已经混合好的，想通过一种方式直接将混合物中两种组分都精确定量。你说的A引物检测B,B引物检测A我不太能理解，从结合效率上，这样两种引物对于单碱基突变模板的Ct变化最大在3左右，当然这是我自己做的不 ...

以下都是乱想的：
1.酶切试试呢，在突变点上找个酶切位点，别的地方再找一个，做双酶切，无突变的就成线性一条带，有突变的变成两条，再用quality one 算下浓度（双酶切是因为都变成线性化的状态比较好吧）
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6楼2014-07-29 10:48:29
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柠萌粉

铜虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
西门吹雪170: 金币+2 2014-07-29 19:10:18
引用回帖:
7楼: Originally posted by linzshit at 2014-07-29 11:34:11
这就是我当初的设想，酶切后混合样本，然后红色和绿色引物组能分别检测其中的一种，由于两种质粒都被酶切成线性的，所以互相之间没有干扰，即使是混合以后，之后就可以按照Ct值大概的换算一下，但是实际情况是，即 ...

不是只有一个点突变吗？怎么画成这个图的？而且即使你要用到QPCR，两对引物是不能直接进行比较的，扩增效率和产物长度不同，真要进行比较，理论上要用绝对定量，或者双标准曲线法
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8楼2014-07-29 12:25:36
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柠萌粉

铜虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
10楼: Originally posted by linzshit at 2014-07-29 15:39:06
是只有一个突变，然后向通过两种酶切把两种分开，上面是酶切示意图，我也觉得是不能直接比较，但实在是没啥好方法了，当然这个也没成功，哈哈
绝对定量是找个标准品分别对比吗？双标准曲线法不太能理解...

双标准曲线是我自己想的，我觉得通过标准曲线得到准确的扩增效率，通过校正(1+E)^CT后再除以扩增片段长度，也可以得到相同的效果，当然两个引物需要手动设置相同的阈值
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14楼2014-07-31 10:37:10
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柠萌粉

铜虫 (正式写手)
引用回帖:
15楼: Originally posted by linzshit at 2014-07-31 11:10:07
这种的我也试过，甚至试过通过最后的峰高、Ct值、扩增效率去推算初始模板量，不过感觉出入还是挺大的。
我想两种质粒的话一个点突变的区别，通过定量得到浓度然后去混合，这种混合结果应该是普遍被认可是正确的吧 ...

我也有过这种需求，所以当初也想了一些办法，最后还是放弃了，我是发现了某基因的两种转录本，也是SNP的差别，想确定他们之间拷贝数的比值
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16楼2014-07-31 13:07:10
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