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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 如何鉴定一种DNA样本中的不同样本类型所占百分比
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linzshit

银虫 (小有名气)

[求助] 如何鉴定一种DNA样本中的不同样本类型所占百分比 已有3人参与

现在遇到一个技术难点，举个例子就是我混合两种不同的质粒A和B，质粒之间只存在一个点的差别，我用定量的方式确定两种质粒的浓度，然后进行混合，混合方式为A/(A+B)=5%，这里的百分比是浓度比。现在问题来了，对于混合后的样本，我想鉴定它到底是不是按我预想的混合成5%了，有什么方法吗？希望大神能够解答，谢谢
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1楼 2014-07-28 14:25:08
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songzuowei

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
linzshit(myprayer代发): 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，分子生物期待你更多精彩。 2014-07-29 11:53:10
大神的不是 可以做soutern blot
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2楼2014-07-28 14:33:14
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柠萌粉

铜虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
linzshit(myprayer代发): 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，分子生物期待你更多精彩。 2014-07-29 11:53:18
southern探针都比较长，单个碱基突变似乎不好做
可以试试看QPCR的方法，把突变点设置为3'最后一个碱基
A引物扩增B的 B引物扩增A的 看看能否达到区分效果（看ct值差别大不大。。）
如果质粒量比较足的话，还可以试试酶切。。
不是大神的路过
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3楼2014-07-28 18:34:46
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linzshit

银虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by songzuowei at 2014-07-28 14:33:14
大神的不是 可以做soutern blot

southern的话是如何做到定量的啊，我需要精确定量到5%，这个能实现吗？
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4楼2014-07-29 09:16:46
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linzshit

银虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 柠萌粉 at 2014-07-28 18:34:46
southern探针都比较长，单个碱基突变似乎不好做
可以试试看QPCR的方法，把突变点设置为3'最后一个碱基
A引物扩增B的 B引物扩增A的 看看能否达到区分效果（看ct值差别大不大。。）
如果质粒量比较足的话，还可以试 ...

我的模板是已经混合好的，想通过一种方式直接将混合物中两种组分都精确定量。你说的A引物检测B,B引物检测A我不太能理解，从结合效率上，这样两种引物对于单碱基突变模板的Ct变化最大在3左右，当然这是我自己做的不算定义，然后只有引物不同的话也无法收到两条扩增曲线啊，望深度指导。
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5楼2014-07-29 09:27:13
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柠萌粉

铜虫 (正式写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by linzshit at 2014-07-29 09:27:13
我的模板是已经混合好的，想通过一种方式直接将混合物中两种组分都精确定量。你说的A引物检测B,B引物检测A我不太能理解，从结合效率上，这样两种引物对于单碱基突变模板的Ct变化最大在3左右，当然这是我自己做的不 ...

以下都是乱想的：
1.酶切试试呢，在突变点上找个酶切位点，别的地方再找一个，做双酶切，无突变的就成线性一条带，有突变的变成两条，再用quality one 算下浓度（双酶切是因为都变成线性化的状态比较好吧）
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6楼2014-07-29 10:48:29
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linzshit

银虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by 柠萌粉 at 2014-07-29 10:48:29
以下都是乱想的：
1.酶切试试呢，在突变点上找个酶切位点，别的地方再找一个，做双酶切，无突变的就成线性一条带，有突变的变成两条，再用quality one 算下浓度（双酶切是因为都变成线性化的状态比较好吧）...

这就是我当初的设想，酶切后混合样本，然后红色和绿色引物组能分别检测其中的一种，由于两种质粒都被酶切成线性的，所以互相之间没有干扰，即使是混合以后，之后就可以按照Ct值大概的换算一下，但是实际情况是，即便是酶切结束了，也不能避免交叉检测为阴性，很蛋疼。
如何鉴定一种DNA样本中的不同样本类型所占百分比
未命名.JPG
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7楼2014-07-29 11:34:11
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柠萌粉

铜虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
西门吹雪170: 金币+2 2014-07-29 19:10:18
引用回帖:
7楼: Originally posted by linzshit at 2014-07-29 11:34:11
这就是我当初的设想，酶切后混合样本，然后红色和绿色引物组能分别检测其中的一种，由于两种质粒都被酶切成线性的，所以互相之间没有干扰，即使是混合以后，之后就可以按照Ct值大概的换算一下，但是实际情况是，即 ...

不是只有一个点突变吗？怎么画成这个图的？而且即使你要用到QPCR，两对引物是不能直接进行比较的，扩增效率和产物长度不同，真要进行比较，理论上要用绝对定量，或者双标准曲线法
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8楼2014-07-29 12:25:36
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songzuowei

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
4楼: Originally posted by linzshit at 2014-07-29 09:16:46
southern的话是如何做到定量的啊，我需要精确定量到5%，这个能实现吗？...

这个难度就比较大了，这玩意可以确定拷贝数，但技术要求比较高
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9楼2014-07-29 14:25:43
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linzshit

银虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by 柠萌粉 at 2014-07-29 12:25:36
不是只有一个点突变吗？怎么画成这个图的？而且即使你要用到QPCR，两对引物是不能直接进行比较的，扩增效率和产物长度不同，真要进行比较，理论上要用绝对定量，或者双标准曲线法...

是只有一个突变，然后向通过两种酶切把两种分开，上面是酶切示意图，我也觉得是不能直接比较，但实在是没啥好方法了，当然这个也没成功，哈哈
绝对定量是找个标准品分别对比吗？双标准曲线法不太能理解
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10楼2014-07-29 15:39:06
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