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三爷111

金虫 (小有名气)

[求助] 关于BMDM-骨髓来源的巨噬细胞的培养。 已有2人参与

最近在用骨髓细胞诱导巨噬细胞，冲出骨髓-过筛网-裂红之后将细胞放在大培养皿里让其贴壁2h后，取上清放到新的培养皿里加1640完全培养基和50ng/ml的M-CSF培养6天，中间半量换液两次。但养出来的细胞在20倍镜下观察胞内有空泡，不知道是怎么会事，是细胞本身就是这样还是细胞因子的用量太大呢？求高人指教啊！

关于BMDM-骨髓来源的巨噬细胞的培养。
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巨噬细胞实验

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1楼 2014-07-01 11:48:12
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

ChangeJ

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
14楼: Originally posted by cordeliawrx at 2015-12-08 17:53:44
楼主你好，现在你还养BMDM吗？我刚开始养，实验室之前也没人养过，完全自己摸索，养出的细胞也是这个样子。这是正常的吗？状态好的BMDM应该是什么样子的啊？可以分享一张图看吗？非常感谢！

我一直在养BMDM
图中的细胞一看就是培养的时间太久了，cell confluence 太低，这样已经不好用了。
我们用100ng/mL M-CSF 在 RPMI-1640（5% Pen/Step, 10% FBS)里培养。
第一天算Day0，Day3天添加培养基100ng/mL M-CSF（不换RPMI）
第五天confluence在80%-90% 就可以使用了。
跑过FACS 这时候97%的贴壁细胞都是F4/80+CD11b+
第三天的时候是80%左右。
到第七天有99%以上的细胞都是F4/80+CD11b+,但是这时候细胞数量已经下降的很厉害了。
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三爷111
16楼2016-03-22 01:28:42
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青云瀚海

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
三爷111: 金币+4, ★★★很有帮助 2014-09-16 09:41:50
我们实验室诱导BMDM是这样诱导的：
1、引颈处死小鼠，将小鼠后肢的皮毛剥置足部，连同褪下的皮毛剪去足部，剪下后腿，放入盛有无菌PBS的培养皿中
2、镊子夹住腿骨一端后，用剪刀剔除肌肉，在关节处剪断腿骨
3、 用2mL注射器吸取无血清的1640培养基，将针头刺入骨髓腔，反复冲洗骨髓至骨髓变白，将骨髓冲洗液加入到50mL离心管中，1000rpm离心5min
4、将离心得到的骨髓细胞用10mL含MCSF（50ng/mL）和血清的1640培养基重悬，然后分装到两个25cm2的细胞培养瓶中，置于37℃和5%CO2气体浓度适度的培养箱中培养3天
5、弃上清，换5mL含MCSF（50ng/mL）和血清的1640培养基继续培养4天
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三爷111
其实这个问题是可以解决的！
6楼2014-09-15 16:40:01
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青云瀚海

银虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by 三爷111 at 2014-09-16 09:41:39
非常感谢您的回答，我还想再问一下，你们实验室取下来的骨髓细胞不用贴壁2h-4h之后弃掉贴壁的细胞，收集上清里的细胞这一步吗？是一只老鼠的两条腿的骨髓细胞分成两个培养瓶培养，还是一条腿的骨髓细胞分成两个瓶培 ...

我们实验室没有2h-4h之后弃掉贴壁的细胞，收集上清里的细胞这一步。我下室才半年，这是师兄们所用的诱导巨噬细胞的方法。是两条腿的分成了两瓶（你也可以试一下分三瓶，因为我觉得分两瓶其实密度也挺大的，分三瓶应该也没问题）。诱导好的细胞形态还好，但是必须尽快用，如果超过十几天形态就会变圆。另外，阳性率我没有测过，我的师兄他们之前曾经测过，说是只要诱导成功的差不多都是，所以后来诱导时就没再测过。
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其实这个问题是可以解决的！
8楼2014-09-22 12:37:30
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三爷111

金虫 (小有名气)
送红花一朵
引用回帖:
16楼: Originally posted by ChangeJ at 2016-03-22 01:28:42
我一直在养BMDM
图中的细胞一看就是培养的时间太久了，cell confluence 太低，这样已经不好用了。
我们用100ng/mL M-CSF 在 RPMI-1640（5% Pen/Step, 10% FBS)里培养。
第一天算Day0，Day3天添加培养基100ng/mL ...

谢谢，想问下您是在培养皿还是培养瓶里诱导的啊？取下来的BM细胞以多少细胞每毫升来培养的？培养结束后要使用的话，是用胰酶消化的吗？我之前也养到过4天就用，4天的时候细胞状态还不错，但是用胰酶消化下来的细胞再铺板培养的话，细胞状态又不好了。期待您的回复，谢谢！
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17楼2016-03-22 15:12:27
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普通回帖

yipan

铜虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
细胞老了。营养过剩。个人观点。
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2楼2014-07-01 13:21:01
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三爷111

金虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by yipan at 2014-07-01 13:21:01
细胞老了。营养过剩。个人观点。

那你培养过这种细胞吗？这是要用细胞因子从祖细胞诱导分化过来的，必须要诱导到6-7天的样子。你有什么改进的建议吗？
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3楼2014-07-01 15:12:46
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yipan

铜虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★
三爷111: 金币+1, 基本没有帮助 2014-07-01 21:15:36
这个改进我还真讲不出，按步骤做就挺好。
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4楼2014-07-01 16:19:04
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pudding9696

无虫 (小有名气)
youlinglyw: 应助指数-1, 屏蔽内容, 违规存档, 广告 2014-07-04 15:21:31
本帖内容被屏蔽
5楼2014-07-04 14:29:39
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三爷111

金虫 (小有名气)
送红花一朵
引用回帖:
6楼: Originally posted by 青云瀚海 at 2014-09-15 16:40:01
我们实验室诱导BMDM是这样诱导的：
1、引颈处死小鼠，将小鼠后肢的皮毛剥置足部，连同褪下的皮毛剪去足部，剪下后腿，放入盛有无菌PBS的培养皿中
2、镊子夹住腿骨一端后，用剪刀剔除肌肉，在关节处剪断腿骨
3、  ...

非常感谢您的回答，我还想再问一下，你们实验室取下来的骨髓细胞不用贴壁2h-4h之后弃掉贴壁的细胞，收集上清里的细胞这一步吗？是一只老鼠的两条腿的骨髓细胞分成两个培养瓶培养，还是一条腿的骨髓细胞分成两个瓶培养？另外，你们养出来的BMDM细胞状态好吗？阳性率有多少？非常期待您的答复，谢谢啦。
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7楼2014-09-16 09:41:39
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三爷111

金虫 (小有名气)
内容已删除
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9楼2014-09-23 08:59:58
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落雪无痕725

银虫 (初入文坛)
引用回帖:
6楼: Originally posted by 青云瀚海 at 2014-09-15 16:40:01
我们实验室诱导BMDM是这样诱导的：
1、引颈处死小鼠，将小鼠后肢的皮毛剥置足部，连同褪下的皮毛剪去足部，剪下后腿，放入盛有无菌PBS的培养皿中
2、镊子夹住腿骨一端后，用剪刀剔除肌肉，在关节处剪断腿骨
3、  ...

你好，小弟最近也想做BMM诱导实验，首先感谢你的protocol，有个问题想咨询一下，就是你们把分离出来的骨髓细胞在培养皿中诱导成功后，再如何分离出来，好像单核巨噬细胞贴壁很牢，不容易消化下来，如果诱导好了之后我想用它来做其他实验，或者流式检测，怎样才能最大可能的吧贴壁的巨噬细胞消化下来。小弟新手一枚，望不吝赐教！
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更高、更远、更强！
10楼2015-02-03 11:23:27
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