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阳阳的猫猫金虫 (小有名气)
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WB背景又高了，请教高手
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这是今天的显影结果，BSA封闭室温1h，一抗anti-nitrotyrosine度过夜，二抗anti-rabbit室温2h。和显影液在膜上时间长了有关吗？ nitro.png |
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 蛋白质生物学实验经验 |
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youlinglyw: 金币+3 2014-07-18 12:54:29
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WB背景高的可能原因与解决方法 1.洗膜不充分，增加洗涤液的体积和洗涤次数；在洗涤液中加入Tween=20。 2.二抗浓度过高，引起了一些非专一性的抗原-抗体相互作用，适当降低二抗浓度，可以分梯度进行。 3.二抗的识别抗原免疫簇不唯一，这是因为二抗是多克隆抗体，使用单克隆抗体的二抗，此时二抗的识别抗原免疫簇是唯一的，其非专一性的抗原-抗体相互作用会大为减少。当然，有时，单克隆抗体也会有识别抗原免疫簇不唯一，如果两种蛋白质的抗原免疫簇的结构很相近的话。如果不知道是不是二抗的识别抗原免疫簇不唯一，可以不加一抗的情况下只加二抗实验，可以检测出是否为二抗的的抗原免疫簇的识别的原因，若是的话，可以先更换封闭试剂，若无效，则要同时更换二抗。 4.封闭不充分，增加封闭液的封闭时间，适当提高温度，更换封闭液。 5.曝光过度，缩短曝光时间。 6.检测过程中膜干燥，保持充分的反应液，避免膜干燥。 7．若无别的选择，可尝试选择5%的脱脂奶粉，同时加入Tween=20。 8.滴定一抗或二抗的效价，找到一个产生清晰的信号强度可以接受的较低的抗体浓度。 9.缩短一抗和二抗的孵育时间。 |
8楼2014-07-18 10:28:06