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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 药学 » 药物化学 » DEAE纤维柱断层求助
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陶盛昌

木虫 (正式写手)

[求助] DEAE纤维柱断层求助已有2人参与

求助，各位虫友，我的柱子装好后，加恒流泵后经常断层，不知何因？填料是DEAE-52，柱子是中压层析柱，200g的填料溶于400ml的水，填料上柱前，放入抽滤瓶里真空脱过起泡，上柱沉降后没什么问题，但恒流泵平衡后，会出现断层的现象，各位知道为什么吗，给些建议，求教
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@@@@@@
1楼2014-05-26 10:44:57
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神雕哥

木虫 (正式写手)
引用回帖:
8楼: Originally posted by 陶盛昌 at 2014-06-02 19:35:45
谢谢神雕哥，我的平衡时间有18个小时，我洗脱样品的流速确实是1ml/min，平衡的流速也是1ml/min，不知道到时候会不会有什么问题？我的填料是国产的，上海源叶生物的，有可能是国产的均一性不好，柱高的话已经平衡好 ...

你可以试试，不过我不知道你是从什么里面提取出的多糖，还有你上柱子前多糖处理过没有，如果你的粗多糖只是水提醇沉得到话，应该进行脱色、脱蛋白处理，否则会影响到你得分离效果。至于你上样量的问题，你问厂家也是白问，不同糖上样量不一样的。DEAE-52是阴离子交换柱，用来分离中性多糖和酸性多糖。上样后一般都是阶段性梯度洗脱，洗脱液一般是水、0.1、0.3、0.5、0.7mol/L的NaCl，其中水洗下来的为中性多糖。你的上样量根据我的经验和你的填料量上1g应该不是问题，但我不了解你得多糖只能这样推测。想确定上样量是否过载：1.先进行预实验，少量上样（可以是几百毫克，建议不要太多，这一步最好不要过载），看你的多糖各个洗脱阶段的洗脱情况。2.假如你的多糖是酸性多糖和中性多糖的混合多糖，你就可以做出洗脱曲线。3.这一步你可以增加上样量，可以增加一倍或者按照三分之二增加（假如原来上样600mg，这次你可以上样1g），然后绘制洗脱曲线，假如刚开始洗脱不久就有多糖出来同时者其他洗脱组分峰（中性多糖组分和酸性多糖组分）未明显增加说明你过载了，反之你可以继续增加上样量。4.假如只有酸性多糖，原理与上面的方法一样的。如果你前期脱色脱蛋白了，可以先试试
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陶盛昌
11楼2014-06-03 14:18:03
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神雕哥

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
辣笔v小新: 金币+2, 鼓励应助交流 2014-05-26 12:35:24
陶盛昌: 金币+5, ★★★很有帮助 2014-05-26 14:50:17
DEAE-52属于阴离子交换柱，一般上柱前先得预处理，一般是保存在一定浓度的乙醇中，先得用水充分溶胀（过夜）并除去其中的乙醇和不溶物，建议过夜后用水多洗几次。然后用碱-酸-碱处理，并用蒸馏水洗至中性即可上柱。不知道楼主这些做没做，如果做了，还断层请问你得柱子什么规格，纤维素柱一般用短粗的，平衡流速一般1ml/min，这个平衡时的流速一定要大于你得上样后的洗脱流速，不然可能会断层或者降低柱效，造成你试验的重现性差，请楼主参考
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2楼2014-05-26 11:05:19
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lihuan0525

金虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

你用蠕动泵给柱子的压力是怎么加上去的， 是一下加上去的，还是慢慢加上去的，还有你用了多长时间加压。最好是慢慢的加压，不要一下就用一个大压力。
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6楼2014-05-28 13:18:29
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神雕哥

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

你这个我个人认为有几种可能，一种就是你装柱子时填料一定要混匀，用玻璃棒引流装柱.还有就是你平衡的时间不够，平衡柱子时一定要平衡到你的柱高不再下降，否则影响柱效和重现性，你可以增加平衡时间，观察柱高。还有就是想问下你上样后的洗脱样品的流速是多少，如果也是1ml/min，那你平衡柱子时的流速要比它大。还有就是你的填料是国产的还是进口的，国产的有时均一性不好也会出现这种情况，只要保证柱高不变分离效果和重现性也没问题的，前期是你排除掉装柱时的其它问题的可能性。

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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7楼2014-06-01 06:36:43
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普通回帖

陶盛昌

木虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 神雕哥 at 2014-05-26 11:05:19
DEAE-52属于阴离子交换柱，一般上柱前先得预处理，一般是保存在一定浓度的乙醇中，先得用水充分溶胀（过夜）并除去其中的乙醇和不溶物，建议过夜后用水多洗几次。然后用碱-酸-碱处理，并用蒸馏水洗至中性即可上柱。 ...

谢谢神雕哥，前处理都没问题，是用碱酸碱处理过的，平衡速度也是1ml每分钟，不过上样前真空抽除气泡时有些小气泡除不去，不知道是不是那个影响？柱子上层有些皱纹，不致密，不知何因？神雕哥帮忙看看
DEAE纤维柱断层求助


DEAE纤维柱断层求助-1
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@@@@@@
3楼2014-05-26 11:55:01
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lihuan0525

金虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
陶盛昌: 金币+2 2014-05-26 14:49:11
楼主不知道你怎么装柱的，我以前装过纯化蛋白的，也是离子交换的， 在装完后需要用蠕动泵给柱子一个压力，把填料压实，然后再把柱中多余的水分给拍出来。
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4楼2014-05-26 13:13:01
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陶盛昌

木虫 (正式写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by lihuan0525 at 2014-05-26 13:13:01
楼主不知道你怎么装柱的，我以前装过纯化蛋白的，也是离子交换的， 在装完后需要用蠕动泵给柱子一个压力，把填料压实，然后再把柱中多余的水分给拍出来。

先谢谢lihuan0525，我的装柱步骤是：将层析柱清洗干净垂直固定到层析架上，加1/3体积的无离子水，打开下出液口，水流畅通，即刻将小烧杯中装有适宜浓度的柱材（填料真空抽除过气泡后），轻轻倒入层析柱中，树脂自然慢慢沉降再层析柱底部，树脂沉积直到离层析柱上端1.5－2cm处，停止装柱。然后接蠕动泵给他一个压力，但就会出现上图的那种现象，请问何解？加的压力也不是很大啊，恒流泵就40转每分钟，谢谢
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@@@@@@
5楼2014-05-26 14:47:39
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陶盛昌

木虫 (正式写手)
引用回帖:
7楼: Originally posted by 神雕哥 at 2014-06-01 06:36:43
你这个我个人认为有几种可能，一种就是你装柱子时填料一定要混匀，用玻璃棒引流装柱.还有就是你平衡的时间不够，平衡柱子时一定要平衡到你的柱高不再下降，否则影响柱效和重现性，你可以增加平衡时间，观察柱高。还 ...

谢谢神雕哥，我的平衡时间有18个小时，我洗脱样品的流速确实是1ml/min，平衡的流速也是1ml/min，不知道到时候会不会有什么问题？我的填料是国产的，上海源叶生物的，有可能是国产的均一性不好，柱高的话已经平衡好了，我平衡了18个小时，柱高没什么变化了。我装了几次柱子，都会出现皱纹，我想会不会就是这样的，只要不断层，没有大气泡，柱高稳定，应该不会有什么问题，所以我准备先上样洗脱观察结果怎么样，如果一切正常，那么柱子有些小皱纹就应该是没有什么大影响的。还有顺便问问，我的柱子是3.5*50cm的中压柱，装的是200g的DEAE-52，如果上样的话，上样的量应该是多少？我查了很多文献，大多只上几百毫克，我想问这个有没有什么规律，多少量的DEAE-52可以上多少量的样品？我有10g的粗多糖，要是每次只上几百毫克，那要上好多次，很有点繁琐。请神雕哥指点，谢谢
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@@@@@@
8楼2014-06-02 19:35:45
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陶盛昌

木虫 (正式写手)
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6楼: Originally posted by lihuan0525 at 2014-05-28 13:18:29
你用蠕动泵给柱子的压力是怎么加上去的， 是一下加上去的，还是慢慢加上去的，还有你用了多长时间加压。最好是慢慢的加压，不要一下就用一个大压力。

我的蠕动泵的压力是一下子加上去的，我加压了18个小时，看到柱高不再变化了，就没有再平衡了。那可能跟这个也有点关系，请问lihuan0525上样量的问题，200g的DEAE-52,3.5*55cm的中压柱该上多少样品?我看了一些文献，本打算上样30mg/ml的粗多糖10ml，但感觉这样子的话，我10g的粗多糖要上很多次，请问能一次上多一点吗？1g左右行不行？
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9楼2014-06-02 19:43:12
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lihuan0525

金虫 (职业作家)
引用回帖:
9楼: Originally posted by 陶盛昌 at 2014-06-02 19:43:12
我的蠕动泵的压力是一下子加上去的，我加压了18个小时，看到柱高不再变化了，就没有再平衡了。那可能跟这个也有点关系，请问lihuan0525上样量的问题，200g的DEAE-52,3.5*55cm的中压柱该上多少样品?我看了一些文献， ...

这个和你的填料的吸附性有关，因为一旦吸附饱和了，你在过柱子，也无法吸住了，都会随着上样液流走，所以楼主要问问厂家那边离子载量
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10楼2014-06-03 09:10:53
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