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华农夏田

铁虫 (正式写手)

[交流] P-AKT/AKTwestern blot 已有1人参与

有没有虫友在做P-AKT/AKTwestern blot的？想做心肌细胞 P-AKT/AKT蛋白表达水平，大家的细胞都是现提蛋白跑胶么？
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要科研也要生活
1楼 2014-04-28 20:25:19
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CasGene

铜虫 (初入文坛)
★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
youlinglyw: 金币+2, 感谢经验分享 2014-05-02 19:14:01
要现提，否则p-AKT会丢失。
在裂解过程中，phosphatase可能会把p-AKT水解掉。
最好的办法就是直接用1XSDS煮了。
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2楼2014-04-29 13:43:40
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华农夏田

铁虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by CasGene at 2014-04-29 13:43:40
要现提，否则p-AKT会丢失。
在裂解过程中，phosphatase可能会把p-AKT水解掉。
最好的办法就是直接用1XSDS煮了。

我是先用RIPA加磷酸酶抑制剂提后再用1XLODING煮，不过还没做过P-AKT的western。
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要科研也要生活
3楼2014-04-30 16:31:06
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华农夏田

铁虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by CasGene at 2014-04-29 13:43:40
要现提，否则p-AKT会丢失。
在裂解过程中，phosphatase可能会把p-AKT水解掉。
最好的办法就是直接用1XSDS煮了。

你们不用RIPA就直接用loading buffer煮？
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要科研也要生活
4楼2014-04-30 16:32:32
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CasGene

铜虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
4楼: Originally posted by 华农夏田 at 2014-04-30 16:32:32
你们不用RIPA就直接用loading buffer煮？...

如果技术高超，可以RIPA+phospho inhibitor
但很多同学做实验不够仔细，导致在收细胞的过程中就去磷酸化了。

直接煮的办法保证他们能做出来。
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5楼2014-05-02 18:22:05
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华农夏田

铁虫 (正式写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by CasGene at 2014-05-02 18:22:05
如果技术高超，可以RIPA+phospho inhibitor
但很多同学做实验不够仔细，导致在收细胞的过程中就去磷酸化了。

直接煮的办法保证他们能做出来。...

那我的细胞是原代贴壁的，非得加RIPA(冰上)操作加磷酸酶抑制剂，裂解10min直接加1x loading buffer煮，这样做能保证做出来吧？
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要科研也要生活
6楼2014-05-02 20:54:00
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CasGene

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
6楼: Originally posted by 华农夏田 at 2014-05-02 20:54:00
那我的细胞是原代贴壁的，非得加RIPA(冰上)操作加磷酸酶抑制剂，裂解10min直接加1x loading buffer煮，这样做能保证做出来吧？...

应该可以
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7楼2014-05-04 10:09:41
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华农夏田

铁虫 (正式写手)
引用回帖:
7楼: Originally posted by CasGene at 2014-05-04 10:09:41
应该可以...

昨天仍然没做出来，怀疑是一抗的问题
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要科研也要生活
8楼2014-05-05 11:37:28
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