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tu475575025

新虫 (小有名气)

[求助] 外源片段比载体大,构建时很诡异 已有5人参与

载体只有3k,我要连的片段有3.6k,用双酶切(一个粘性,个平端),第一次转化后一个子也没有长,想请教这种情况在连接时是否需要将载体骨架和片段的比例调整到片段比载体骨架多?
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Neo2000

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香,分子生物期待你更多精彩。 2014-04-11 14:36:39
外源肯定要比载体多,你用了个平末端的位点,这个是不长的原因

[ 发自小木虫客户端 ]
2楼2014-04-11 11:46:55
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tu475575025

新虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by Neo2000 at 2014-04-11 11:46:55
外源肯定要比载体多,你用了个平末端的位点,这个是不长的原因

我已经用一个粘端加一个平端成功构过几个载体了,只是这次骨架较小,片段太大,不知道加大T4酶量或者用soulution I 效果是不是好点
3楼2014-04-11 12:41:25
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tu475575025

新虫 (小有名气)

有做过小骨架连大片段的经验吗,来取点经
4楼2014-04-11 12:42:25
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Neo2000

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
tu475575025: 金币+3 2014-04-11 14:40:53
引用回帖:
4楼: Originally posted by tu475575025 at 2014-04-11 12:42:25
有做过小骨架连大片段的经验吗,来取点经

没有必要加酶量,外源多加点容易达到目的

[ 发自小木虫客户端 ]
5楼2014-04-11 13:27:59
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biostar2009

专家顾问 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
tu475575025(myprayer代发): 金币+3, 赠人玫瑰手有余香,分子生物期待你更多精彩。 2014-04-11 14:36:49
tu475575025: 金币+20, ★★★很有帮助 2014-04-11 14:40:31
你这种还好,载体和片段都不是太大,应该不困难。而且还有一个是粘性的。
这种连接,片段和载体的比例,给1:1最好,最多不要超过2:1,什么8:1的,就很难办了。
剩下的就按常规的连接来,按你的酶的说明书,要怎么搞就怎么搞

» 本帖已获得的红花(最新10朵)

6楼2014-04-11 14:21:34
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draco1987

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
tu475575025(myprayer代发): 金币+1, 赠人玫瑰手有余香,分子生物期待你更多精彩。 2014-04-11 14:36:59
tu475575025: 金币+2 2014-04-11 14:41:05
载体3k、片段3.6k很平常啊,一般不都是片段和载体摩尔比3:1吗?
7楼2014-04-11 14:35:13
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tu475575025

新虫 (小有名气)

送红花一朵
引用回帖:
6楼: Originally posted by biostar2009 at 2014-04-11 14:21:34
你这种还好,载体和片段都不是太大,应该不困难。而且还有一个是粘性的。
这种连接,片段和载体的比例,给1:1最好,最多不要超过2:1,什么8:1的,就很难办了。
剩下的就按常规的连接来,按你的酶的说明书,要怎么 ...

第一次连的时候以为很容易,就没想这个问题,片段比例太大,今天在重做,感谢建议~~~~~
8楼2014-04-11 14:39:48
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biostar2009

专家顾问 (正式写手)

引用回帖:
8楼: Originally posted by tu475575025 at 2014-04-11 14:39:48
第一次连的时候以为很容易,就没想这个问题,片段比例太大,今天在重做,感谢建议~~~~~...

这种载体酶切脱磷什么的要最好一点。
9楼2014-04-11 14:42:58
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tu475575025

新虫 (小有名气)

引用回帖:
9楼: Originally posted by biostar2009 at 2014-04-11 14:42:58
这种载体酶切脱磷什么的要最好一点。...

载体分步酶切的,先用粘性酶切透了胶回收,再切的另一头平端,没有转化子,应该是不会有自连的情况。以前也试过这种情况,长出来的全是目标转化子,没有发现自连的情况
10楼2014-04-11 16:07:32
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