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neurovas金虫 (小有名气)
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求助帖，看看这段话什么意思？ 已有1人参与
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Hemoglobin from bovine blood was obtained from Sigma. Methemoglobin was prepared by oxidation of Hb with a 2-fold excess of potassium ferricyanide and passage through a Sephadex G-25 column using 10 mM phosphate buffer (pH 7.0) as an eluent. Oxyhemoglobin was obtained by reduction of Hb with a 10-fold excess of sodium dithionite. The solution was then bubbled with O2 and purified on a Sephadex G-25 column. Concentrations of metHb and oxyHb were determined spectrophotometrically using ε405 = 1.79 × 105 M–1 cm–1 and ε500 = 1.00 × 104 M–1 cm–1 for metHb, ε415 = 1.25 × 105 M–1 cm–1 and ε577 = 1.38 × 104 M–1 cm–1 for oxyHb, b, expressed per heme (Antonini & Brunori, 1971). FerrylHb was prepared by incubation 1.5 × 10–5 M MetHb with an equimolar amount of H2O2 in relation to the heme group in 10 mM phosphate buffer at room temperature for 5 min (Sztiller et al., 2006). 重点是 ε415 = 1.25 × 105 M–1 cm–1 and ε577 = 1.38 × 104 M–1 cm–1 for oxyHb, 测完这两个值之后，是相加得出oxyHb的浓度吗？文章里面似乎并没有讲清楚。求助各位高手给解决一下！ 下面附有全文！谢谢！ |
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2014-03-08 20:16:28, 871.61 K
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有看过这篇paper么? http://www.sciencedirect.com/sci ... i/S0014579398813458 也提到类似的东西，或许可以给你一点提示…… |
2楼2014-03-21 07:45:45
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【答案】应助回帖
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我谈谈我的理解 很明显这两个epsilon值相差很大 ε405 = 1.79 × 105 M–1 cm–1 and ε500 = 1.00 × 104 M–1 cm–1 for metHb, 这里405nm是文中提到的max值，理论上测这个值就可以算出metHb的浓度 但是这里有一个问题，就是他metHb是怎么来的？ 他是从Hb氧化而来，而Hb在这个区段同样有很强的光吸收，只要是反应，就不可能是100%的， 所以我觉得他后面选的那个500nm，应该是选的对MetHb而言光吸收很少，但是Hb还有相当光吸收的区段，等于这个是测光的本底，要把405nm处测的MetHb+Hb，减去500 nm处测的Hb本底。 ε415 = 1.25 × 105 M–1 cm–1 and ε577 = 1.38 × 104 M–1 cm–1 for oxyHb, 这个应该是同理 我找到的Hb和OxyHb的吸收光谱图 很明显到了577nm，OxyHb的光吸收已经很少，而Hb还有相当的光吸收。 供你参考！  QQ截图20140321151039.png |
5楼2014-03-21 15:11:57
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就我查了一会，其实怎么定量不同类型的血红蛋白，有很多方法，争议也就在于取什么波长，考虑的无非两点， 第一，待测物在这个波长的光吸收能力要强，这样才能测的准 第二，这个波长，除了待测物之外，其他物质的光吸收要最弱，这样才能干扰小 比如蛋白质和核酸，这个做生化的都知道，一个最大在280，一个在260，但是很明显280处核酸也有相当的吸收，反之亦然。 所以测蛋白，尤其是核酸，要讲究一个260/280的比值，用这个表示纯度。也就是说，根据260光吸收算出来的值准不准，要取决于这个样品纯不纯。 对于血红蛋白而言，这一点更难实现，不管是什么状态的血红蛋白，导致强光吸收能力的还是heme，heme的大pai键，所以导致不管什么类型，他们的最大光吸收波长相差不大，而如果根据选择待测物最大光吸收波长处测量误差最小的原则，就同样伴随着背景最高。 所以我的理解是你引用的方法中，权宜之计只好再选一个，待测物光吸收能力较弱，而已经背景还有相当强光吸收的波段，测得背景。 所以实际操作很简单 每一份样品你都测415nm和577nm，得到两个光吸收值，然后算出浓度 浓度相减，就得到你待测物的理论实际浓度 希望有所帮助 |
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neurovas7楼2014-03-22 11:23:35
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8楼2014-03-23 00:17:29
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