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neurovas

金虫 (小有名气)

[求助] 求助帖，看看这段话什么意思？ 已有1人参与

Hemoglobin from bovine blood was obtained from Sigma. Methemoglobin was prepared by oxidation of Hb with a 2-fold excess of potassium ferricyanide
and passage through a Sephadex G-25 column using 10 mM phosphate buffer (pH 7.0) as an eluent. Oxyhemoglobin was obtained by reduction of Hb with a 10-fold excess of sodium dithionite. The solution was then bubbled with O2 and purified on a Sephadex G-25 column. Concentrations of metHb and oxyHb were determined spectrophotometrically using ε405 = 1.79 × 105 M–1 cm–1 and ε500 = 1.00 × 104 M–1 cm–1 for metHb, ε415 = 1.25 × 105 M–1 cm–1 and ε577 = 1.38 × 104 M–1 cm–1 for oxyHb, b, expressed per heme (Antonini & Brunori, 1971). FerrylHb was prepared by incubation 1.5 × 10–5 M MetHb with an equimolar amount of H2O2 in relation to the heme group in 10 mM phosphate buffer at room temperature for 5 min (Sztiller et al., 2006).

重点是 ε415 = 1.25 × 105 M–1 cm–1 and ε577 = 1.38 × 104 M–1 cm–1 for oxyHb, 测完这两个值之后，是相加得出oxyHb的浓度吗？文章里面似乎并没有讲清楚。求助各位高手给解决一下！
下面附有全文！谢谢！
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  • 附件 1 : Flavonoids_as_reductants_of_ferryl_hemoglobin.pdf
    • 2014-03-08 20:16:28, 871.61 K

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1楼 2014-03-08 20:17:44
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littant

银虫 (小有名气)
有看过这篇paper么?
http://www.sciencedirect.com/sci ... i/S0014579398813458

也提到类似的东西，或许可以给你一点提示……
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2楼2014-03-21 07:45:45
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biostar2009

专家顾问 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
neurovas(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-03-21 10:31:05
neurovas: 金币+10, ★有帮助 2014-03-21 12:49:44
这个epsilon是光吸收中的摩尔消光系数
告诉你的是理论值
然后你去测这两个波长的光，用比尔-朗博公式算浓度
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3楼2014-03-21 09:04:20
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neurovas

金虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by biostar2009 at 2014-03-21 09:04:20
这个epsilon是光吸收中的摩尔消光系数
告诉你的是理论值
然后你去测这两个波长的光，用比尔-朗博公式算浓度

但是为什么给了两个公式呢，一个不就够用了吗

[ 发自小木虫客户端 ]
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4楼2014-03-21 12:49:06
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biostar2009

专家顾问 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
neurovas: 金币+9, ★★★★★最佳答案 2014-03-21 20:29:13
我谈谈我的理解
很明显这两个epsilon值相差很大
ε405 = 1.79 × 105 M–1 cm–1 and ε500 = 1.00 × 104 M–1 cm–1 for metHb,
这里405nm是文中提到的max值，理论上测这个值就可以算出metHb的浓度
但是这里有一个问题，就是他metHb是怎么来的？
他是从Hb氧化而来，而Hb在这个区段同样有很强的光吸收，只要是反应，就不可能是100%的，
所以我觉得他后面选的那个500nm，应该是选的对MetHb而言光吸收很少，但是Hb还有相当光吸收的区段，等于这个是测光的本底，要把405nm处测的MetHb+Hb，减去500 nm处测的Hb本底。
ε415 = 1.25 × 105 M–1 cm–1 and ε577 = 1.38 × 104 M–1 cm–1 for oxyHb,
这个应该是同理
我找到的Hb和OxyHb的吸收光谱图
很明显到了577nm，OxyHb的光吸收已经很少，而Hb还有相当的光吸收。
供你参考！
求助帖，看看这段话什么意思？
QQ截图20140321151039.png
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5楼2014-03-21 15:11:57
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neurovas

金虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by biostar2009 at 2014-03-21 15:11:57
我谈谈我的理解
很明显这两个epsilon值相差很大
ε405 = 1.79 × 105 M–1 cm–1 and ε500 = 1.00 × 104 M–1 cm–1 for metHb,
这里405nm是文中提到的max值，理论上测这个值就可以算出metHb的浓度
但是这里 ...

虽然我看不懂，但肯定是遇见高人了，我是神经外科，干临床的，对这个不太懂！那你的意思是：我测出ε415 = 1.25 × 105 M–1 cm–1 and ε577 = 1.38 × 104 M–1 cm–1 for oxyHb, 这两个值之后，相减就是我要的OxyHb的浓度了吗？求赐教！
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6楼2014-03-21 20:29:15
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biostar2009

专家顾问 (正式写手)
引用回帖:
6楼: Originally posted by neurovas at 2014-03-21 20:29:15
虽然我看不懂，但肯定是遇见高人了，我是神经外科，干临床的，对这个不太懂！那你的意思是：我测出ε415 = 1.25 × 105 M–1 cm–1 and ε577 = 1.38 × 104 M–1 cm–1 for oxyHb, 这两个值之后，相减就是我要的O ...

就我查了一会，其实怎么定量不同类型的血红蛋白，有很多方法，争议也就在于取什么波长，考虑的无非两点，
第一，待测物在这个波长的光吸收能力要强，这样才能测的准
第二，这个波长，除了待测物之外，其他物质的光吸收要最弱，这样才能干扰小
比如蛋白质和核酸，这个做生化的都知道，一个最大在280，一个在260，但是很明显280处核酸也有相当的吸收，反之亦然。
所以测蛋白，尤其是核酸，要讲究一个260/280的比值，用这个表示纯度。也就是说，根据260光吸收算出来的值准不准，要取决于这个样品纯不纯。

对于血红蛋白而言，这一点更难实现，不管是什么状态的血红蛋白，导致强光吸收能力的还是heme，heme的大pai键，所以导致不管什么类型，他们的最大光吸收波长相差不大，而如果根据选择待测物最大光吸收波长处测量误差最小的原则，就同样伴随着背景最高。
所以我的理解是你引用的方法中，权宜之计只好再选一个，待测物光吸收能力较弱，而已经背景还有相当强光吸收的波段，测得背景。
所以实际操作很简单
每一份样品你都测415nm和577nm，得到两个光吸收值，然后算出浓度
浓度相减，就得到你待测物的理论实际浓度
希望有所帮助
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neurovas
7楼2014-03-22 11:23:35
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neurovas

金虫 (小有名气)
送红花一朵
引用回帖:
7楼: Originally posted by biostar2009 at 2014-03-22 11:23:35
就我查了一会，其实怎么定量不同类型的血红蛋白，有很多方法，争议也就在于取什么波长，考虑的无非两点，
第一，待测物在这个波长的光吸收能力要强，这样才能测的准
第二，这个波长，除了待测物之外，其他物质的 ...

谢谢！
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8楼2014-03-23 00:17:29
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