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seo.d_park木虫 (正式写手)
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关于Cloning的问题，求救啊~~ 已有5人参与
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我在做的cloning， 我的几个mutant...Ligation,enzyme cutting 确认, sequencing, Protein expression这些都没有问题。 所以准备做Maxi prep来大量提取DNA。 但是问题就出在这儿。 之前的步骤一直是拿取的colony 在4ml LB broth培养(3ml培养，1ml做了Stock)后，Mini prep提取的DNA做的。 然后确定DNA没问题后，拿stock做 Maxi prep。 (stock是 菌液：DMSO=4:1 制作的 500ul,然后放入-80℃的freezer 冷冻保管。) 在做Maxi 时候（确认培养液浑浊后），取少量(3ml)又用restriction enzyme 切了一遍，发现没有之前(Colony提取的DNA) Insert band 明显(DNA量加到2ug才能隐约看到Insert band,有几个根本看不到，之前用1ug 就能看到明显的insert band，我所做的Insert size 是200~700bp，restriction enzyme 前后端一起切的,用的是takara的，1ug/1ug）。 然后继续确认了Protein expression，与之前一样用了1ug 进行了transfection,但是没有出现Band。 所以我又疑惑把Maxi prep提取的DNA切了一遍，insert这次根本切不掉了。 这到底是什么问题啊。。 不可能是在培养过程中变异或者在freezer里面变异了吧。。。 求解啊~~  上面的图是1ug cutting,下面的是2ug... colony cutting(下面的Band).jpg  stock cutting(下数第二个band).jpg |
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