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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 求助，cloning大侠 基础~
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seo.d_park

木虫 (正式写手)

[求助] 求助，cloning大侠 基础~ 已有3人参与

我的Vector 和 Insert DNA 在用限制性内切酶切完后在0.8% agarose gel 上确认了size,切完后size没问题。
Ligation结束后 把 提纯的DNA在0.8%agarose gel上确认，size偏小。
我以为是Insert DNA 和 Vector 的问题，所以把Ligation结束的DNA 取少量用之前的 restriction enzyme又切了一遍，然后确认了size,切完后的size没问题，就是一进行Ligation 然后确认size 就偏小。。（本来应该在4.8kb左右，但是Band在4kb左右.)
vector和 Insert DNA的 size没问题，就是Ligation结束后 比理论上的size(Vector size + Insert DNA size) 小，这到底是为什么啊？
以下是我的5个sample  
Vector size:4679bp
Insert size:225bp,675bp,516bp,720bp,390bp
Ligation 结束后理论上应该是:4.8kb 5.3kb 5.1kb 5.3kb 5kb
求助，cloning大侠 基础~
cut.jpg


求助，cloning大侠 基础~-1
uncut.jpg


求助，cloning大侠 基础~-2
uncut &cut.jpg

[ Last edited by seo.d_park on 2014-1-16 at 11:02 ]
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1楼 2014-01-16 10:58:30
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鬼羽帝魂

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+3, 鼓励交流 2014-01-17 12:48:50
seo.d_park: 金币+10 2014-01-17 14:25:20
首先，你点样的太多了。你这个可以点0.5的样混合，取2ul去跑样。
再者，样多了就亮，就会成块聚集在一起，本来不好分的带更看不出来了。
第三，这种情况我也碰到过，因为质粒提出来后有三种形态，不一定会怎样。


Ligation结束的DNA 取少量用之前的 restriction enzyme又切了一遍。   这种做法有不合理的地方，酶切验证最好换一种酶单酶切。
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2楼2014-01-16 15:06:32
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jkjr111614

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+3, 鼓励交流 2014-01-17 12:48:54
seo.d_park: 金币+5 2014-01-17 14:25:25
双链DNA可能有链状，环装，超螺旋的结构，电泳表现不同
就算小提质粒，跑出来还可能有三个大小的条带呢
单酶切一下，再跑
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3楼2014-01-16 16:05:16
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zhaozhibozhi

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+3, 鼓励交流 2014-01-17 12:48:57
seo.d_park: 金币+5 2014-01-17 14:25:28
连接后重组片段成环状，就应该偏小一些。如果想确切知道大小，重组片段单酶切后电泳，片段大小就与预期相符了。

楼主连接时用的DNA片段的亮好多啊，连后还能再切！！
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做一个阳光、开朗的小和尚
4楼2014-01-17 08:36:19
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fallenleafc

新虫 (初入文坛)
★ ★ ★
gyesang: 金币+3, 鼓励回帖交流！ 2014-03-28 18:03:05
呃 关于未酶切质粒 大小就应该是明显小于设计大小 更多的质粒是超螺旋的 电泳行为更接近于略小的线性DNA 如果调整电泳和曝光参数合适的话 能看见 实际上是3条带的 呃……

还有 以后如果跑质粒的电泳 建议质粒稀释后上样 而不是质粒原液上样 那样会好看一些 质粒也不宜上得太多 如果不是为了看下面的酶切跳带 上个100ng就很过了 如果为了看下面的卸载的条带大小 建议直接过量上酶切产物 否则下面条带看不清楚的 如果插入片段里还有酶切的位点 那就更碎了 呃

祝君好运啦
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5楼2014-01-18 14:19:18
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