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seven拂晓

新虫 (初入文坛)

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[求助] 做分子的高手们来看看啊已有5人参与

各位高手：
  我是想把一段序列从PCANTAB5E上换到pet26b上，但是在菌落pcr验证这一步，结果始终是不对，电泳结果是在100bp那出现弥散性条带。
  我是这样做的：1.扩增出目的片段
                        2.目的片段与pet26b的双酶切
                        3.连接
                        4.转化到JM109，涂板，
                        5.挑克隆，pcr（程序和体系与第一步的相同）
      结果如上述
我今天又重新提了一次pet26b的质粒，同时提了第四步涂得平板的单菌落的质粒，结果如图：发现重组质粒比原始质粒大了将近1500bp，我的目的片段大约是750bp
大家知不知道这是什么原因啊啊啊啊啊愁死我了我都做了4遍了

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1楼 2014-01-17 22:28:33

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wanghuiym

新虫 (初入文坛)

应助: 1 (幼儿园)
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专业: 植物学研究的新技术、新方

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+5, 鼓励交流！ 2014-01-18 16:11:48

先从基本问题考虑吧，分子实验有时候真的是靠细节和运气的
1.不同的公司的酶和缓冲液质量不一样，首先要排除这个问题。
2.酶和缓冲液的匹配问题，双酶切的缓冲液和单个酶切割的缓冲液是不一样的。
3.酶的用量不能过多，酶是保存在甘油里的，甘油会导致星星反应。

还有分离dna后，酒精是不是残留的太多等等。这些都需要注意。以上都是本人上课时，老师讲的内容，希望对你有帮助。

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