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seven拂晓

新虫 (初入文坛)

[求助] 做分子的高手们来看看啊 已有5人参与

各位高手:
  我是想把一段序列从PCANTAB5E上换到pet26b上,但是在菌落pcr验证这一步,结果始终是不对,电泳结果是在100bp那出现弥散性条带。
  我是这样做的:1.扩增出目的片段
                           2.目的片段与pet26b的双酶切
                           3.连接
                           4.转化到JM109,涂板,
                           5.挑克隆,pcr(程序和体系与第一步的相同)
         结果如上述
我今天又重新提了一次pet26b的质粒,同时提了第四步涂得平板的单菌落的质粒,结果如图:发现重组质粒比原始质粒大了将近1500bp,我的目的片段大约是750bp
    大家知不知道这是什么原因啊啊啊啊啊 愁死我了 我都做了4遍了
做分子的高手们来看看啊
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wanghuiym

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
gyesang: 金币+5, 鼓励交流! 2014-01-18 16:11:48
先从基本问题考虑吧,分子实验有时候真的是靠细节和运气的
1.不同的公司的酶和缓冲液质量不一样,首先要排除这个问题。
2.酶和缓冲液的匹配问题,双酶切的缓冲液和单个酶切割的缓冲液是不一样的。
3.酶的用量不能过多,酶是保存在甘油里的,甘油会导致星星反应。

还有分离dna后,酒精是不是残留的太多等等。这些都需要注意。以上都是本人上课时,老师讲的内容,希望对你有帮助。

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
2楼2014-01-18 08:35:55
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jing20071115

金虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
个人粗见:可以尝试换一对引物(不同编码的)试试,换另一种酶切试试。
3楼2014-01-18 09:12:49
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励交流! 2014-01-18 16:11:59
seven拂晓: 金币+2, 有帮助 2014-01-19 13:03:04
比较质粒大小时做单酶切了吗?超螺旋质粒的迁移率与线性分子的差别很大,不容易比较大小。
4楼2014-01-18 10:12:46
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zhaozhibozhi

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励交流! 2014-01-18 16:12:06
seven拂晓: 金币+2, 有帮助 2014-01-19 13:03:17
1. 比较大小的话,应该用线性的质粒;依图中来看,估算的大1500bp不太确切。
2. 你可以把重组片段双酶切。
3. 可以尝试用扩增目的片段的引物扩增重组片段。
做一个阳光、开朗的小和尚
5楼2014-01-18 11:04:40
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鬼羽帝魂

木虫 (著名写手)

PCANTAB5E多大?pet26b多大?     pet26b切下的片段多大?
6楼2014-01-18 11:28:19
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seven拂晓

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
4楼: Originally posted by cicelyzh at 2014-01-18 10:12:46
比较质粒大小时做单酶切了吗?超螺旋质粒的迁移率与线性分子的差别很大,不容易比较大小。

两个都是超螺旋结构的质粒比较大小 也要分别进行双酶切吗
7楼2014-01-18 21:32:14
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朱多龙

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流! 2014-03-28 18:00:20
比较常用的质粒在构成重组质粒后,一般只要和原始质粒跑个对照就好了。一般做个单酶切就能判断是否连接上外源片段。但是有时候超螺旋的质粒跟单酶切的质粒大小几乎是不变的,我就遇到过这样的质粒,超螺旋的质粒和单切质粒几乎跑在同样的位置,这个时候就需要做双切了。
8楼2014-01-18 22:43:22
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

引用回帖:
7楼: Originally posted by seven拂晓 at 2014-01-18 21:32:14
两个都是超螺旋结构的质粒比较大小 也要分别进行双酶切吗...

是分别单酶切。DNA分子的迁移率受到构象和盐浓度的影响,酶切后可以避免这个问题。
9楼2014-01-19 09:09:06
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