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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 做分子的高手们来看看啊
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seven拂晓

新虫 (初入文坛)

[求助] 做分子的高手们来看看啊 已有5人参与

各位高手：
  我是想把一段序列从PCANTAB5E上换到pet26b上，但是在菌落pcr验证这一步，结果始终是不对，电泳结果是在100bp那出现弥散性条带。
  我是这样做的：1.扩增出目的片段
                           2.目的片段与pet26b的双酶切
                           3.连接
                           4.转化到JM109，涂板，
                           5.挑克隆，pcr（程序和体系与第一步的相同）
         结果如上述
我今天又重新提了一次pet26b的质粒，同时提了第四步涂得平板的单菌落的质粒，结果如图：发现重组质粒比原始质粒大了将近1500bp，我的目的片段大约是750bp
    大家知不知道这是什么原因啊啊啊啊啊 愁死我了 我都做了4遍了
做分子的高手们来看看啊
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1楼 2014-01-17 22:28:33
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2014-01-18 16:11:59
seven拂晓: 金币+2, ★有帮助 2014-01-19 13:03:04
比较质粒大小时做单酶切了吗？超螺旋质粒的迁移率与线性分子的差别很大，不容易比较大小。
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4楼2014-01-18 10:12:46
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wanghuiym

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+5, 鼓励交流！ 2014-01-18 16:11:48
先从基本问题考虑吧，分子实验有时候真的是靠细节和运气的
1.不同的公司的酶和缓冲液质量不一样，首先要排除这个问题。
2.酶和缓冲液的匹配问题，双酶切的缓冲液和单个酶切割的缓冲液是不一样的。
3.酶的用量不能过多，酶是保存在甘油里的，甘油会导致星星反应。

还有分离dna后，酒精是不是残留的太多等等。这些都需要注意。以上都是本人上课时，老师讲的内容，希望对你有帮助。

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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2楼2014-01-18 08:35:55
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jing20071115

金虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
个人粗见：可以尝试换一对引物（不同编码的）试试，换另一种酶切试试。
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3楼2014-01-18 09:12:49
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zhaozhibozhi

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2014-01-18 16:12:06
seven拂晓: 金币+2, ★有帮助 2014-01-19 13:03:17
1. 比较大小的话，应该用线性的质粒；依图中来看，估算的大1500bp不太确切。
2. 你可以把重组片段双酶切。
3. 可以尝试用扩增目的片段的引物扩增重组片段。
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做一个阳光、开朗的小和尚
5楼2014-01-18 11:04:40
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