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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 微生物液氮冻融法DNA提取
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很安静007

新虫 (初入文坛)

[交流] 微生物液氮冻融法DNA提取 已有3人参与

用的方法为2.细胞破碎：取 1 管菌体沉淀用 600μl 细胞裂解液充分悬浮，然后在液氮30s和 65℃水浴30s中反复冻融 5 次，37℃水浴 10min ；加 30μl 溶菌酶（50mg/mL），加入 30μlSDS 溶液（10%），37℃水浴 30min ；为什么提出的条带是这样子的。
微生物液氮冻融法DNA提取
总DNA条带
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1楼 2014-01-08 22:07:51
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三蛰

铜虫 (小有名气)
★
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不用进行抽提吗？
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我不会！
2楼2014-01-08 22:42:04
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很安静007

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 三蛰 at 2014-01-08 22:42:04
不用进行抽提吗？

具体步骤是这样子的：1.样品处理：5 g豆豉样品加入45 mL灭过菌的生理盐水,振荡30 min,取5 mL溶液置于10
mL离心管中, 400 r/min,离心10 min去沉淀, 8 000rpm/min离心10 min,去上清,菌体用无菌PBS洗3遍后转入2 mL离心管。

2.细胞破碎：取 1 管菌体沉淀用 600μl 细胞裂解液充分悬浮，然后在液氮30s和 65℃水浴30s中反复冻融 5 次，37℃水浴 10min ；加 30μl 溶菌酶（50mg/mL），加入 30μlSDS 溶液（10%），37℃水浴 30min ；

3.提取纯化：随后加入等体积的酚：氯仿：异戊醇（25：24:1），抽提2次，于冰上放置 5min，12000rpm 离心 5min，氯仿：异戊醇（24:1）抽提，于冰上放置 5min，12000rpm 离心 5min，将上清液转移到新的无菌离心管中，直至上清液清澈透明，最后将上清液转入 1.5mL EP 管中；
4.沉淀收集DNA:加入0.8体积的异丙醇，1/10 体积的乙酸钠，轻轻混匀，于-20℃沉淀 30min；12000rpm，离心 5min，弃上清，加入 1mL 预冷的 70% 乙醇，洗涤两次，12000rpm，离心 5min，弃上清后室温自然风干，加入 30μl  ddH2O，使 DNA 溶解。
试剂配制：
1. 细胞裂解液: 细胞裂解液：CTAB 10-50g/L; NaCl 1.0mol/L; EDTA 50mmol/L; Tris 250mmol/L;
用稀盐酸调节 pH 至 8.0。
2. 溶菌酶（50mg/mL）
3. 氯仿：异戊醇（24:1）
4.异丙醇
5. 乙酸钠
6. 70% 乙醇
7. SDS 溶液（10%）
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3楼2014-01-09 09:03:17
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wangweijian

金虫 (小有名气)
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gyesang: 金币+1 2014-01-09 17:18:14
你提的是菌体的DNA，是豆豉中的菌体吧，怎么没有Marker,这样就无法判断是胶的问题还是提得不好，不过感觉提出来东西不纯，菌体量少，可能混有豆豉的DNA
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4楼2014-01-09 12:09:21
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很安静007

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by wangweijian at 2014-01-09 12:09:21
你提的是菌体的DNA，是豆豉中的菌体吧，怎么没有Marker,这样就无法判断是胶的问题还是提得不好，不过感觉提出来东西不纯，菌体量少，可能混有豆豉的DNA

MARKer跑的条带挺好的就是细菌条带是这样子的不知道是为什么。本以为液氮法挺好的。
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5楼2014-01-10 10:00:07
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wangweijian

金虫 (小有名气)
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小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
5楼: Originally posted by 很安静007 at 2014-01-10 10:00:07
MARKer跑的条带挺好的就是细菌条带是这样子的不知道是为什么。本以为液氮法挺好的。...

可以试一下细菌基因组试剂盒，有时候提出的基因组电泳条带不好，但是不影响做PCR
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6楼2014-01-10 16:38:03
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冷雁孤旅

木虫 (著名写手)
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引用回帖:
3楼: Originally posted by 很安静007 at 2014-01-09 09:03:17
具体步骤是这样子的：1.样品处理：5 g豆豉样品加入45 mL灭过菌的生理盐水,振荡30 min,取5 mL溶液置于10
mL离心管中, 400 r/min,离心10 min去沉淀, 8 000rpm/min离心10 min,去上清,菌体用无菌PBS洗3遍后转入2 mL离 ...

第一个 和第二个可以用 后面2个就算了
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生命不息奋斗不止
7楼2014-01-11 12:44:26
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冷雁孤旅

木虫 (著名写手)
我们以前提取了豆豉中细菌的额DNA，后面的PCR有的受 运气不好的话
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生命不息奋斗不止
8楼2014-01-11 12:45:27
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很安静007

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
7楼: Originally posted by 冷雁孤旅 at 2014-01-11 12:44:26
第一个 和第二个可以用 后面2个就算了...

那我试一下，谢谢！
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9楼2014-01-12 12:24:54
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