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抹脖丧

新虫 (初入文坛)

[求助] 求高人指点，为什么我的DGGE图总是这样 已有2人参与

6%的胶，20-45%的变性梯度，片段330bp
求高人指点，为什么我的DGGE图总是这样
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1楼 2014-01-04 20:02:48
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gyl121

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2014-01-05 15:13:45
楼主，你应该把你的引物图谱也亮出来，这样才能看到更多的问题，才能排除；
  DNA模板的浓度问题，模板纯度问题抑或有引物配比问题，没能形成特定条带
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不经一番寒彻骨，怎得梅花扑鼻香？为科学进步不懈努力
2楼2014-01-05 13:18:03
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抹脖丧

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by gyl121 at 2014-01-05 13:18:03
楼主，你应该把你的引物图谱也亮出来，这样才能看到更多的问题，才能排除；
  DNA模板的浓度问题，模板纯度问题抑或有引物配比问题，没能形成特定条带

谢谢你！PCR完跑琼脂糖胶条带清晰而且很亮，模板的浓度都是一百多，个别有二百多的（ng/微升），纯度用nanodrop测得都介于1.8-1.9之间（260/280）。
只有一次，我把CR产物纯化之后再跑胶，图片条带很清楚，但是所有泳道都一样了。都没有继续下去的动力了，不知道哪里出了问题
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3楼2014-01-06 08:49:45
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gyl121

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
kx444555: 金币+3, 鼓励交流 2014-01-09 08:56:17
慢慢来嘛，我目前也碰到不少问题，你的模板是没问题的了，你应该注意体系，引物，酶等，这些也是很重要的，引物是自己设计的吗？听你的意思，好像是要找各样品不同的条带，多态性是吧？
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不经一番寒彻骨，怎得梅花扑鼻香？为科学进步不懈努力
4楼2014-01-07 10:32:37
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sdxlwxs

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2014-01-09 08:56:21
变性梯度选择的范围不合适吧，明显都跑到下面去了
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5楼2014-01-07 11:13:24
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抹脖丧

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by gyl121 at 2014-01-07 10:32:37
慢慢来嘛，我目前也碰到不少问题，你的模板是没问题的了，你应该注意体系，引物，酶等，这些也是很重要的，引物是自己设计的吗？听你的意思，好像是要找各样品不同的条带，多态性是吧？

又试了一下同一块胶上跑纯化的和不纯化的，纯化的很清楚，初步推测是我用的酶不合适，下次换个酶试试
引物是我自己设计的，GC夹是文献上的，
是要看多态性
你用的是什么酶呀？
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6楼2014-01-08 18:19:46
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淼淼兮

新虫 (初入文坛)
我也准备做DGGE请问前辈 PCR产物是怎么纯化的 切胶回收？
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7楼2014-01-12 10:42:45
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抹脖丧

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
7楼: Originally posted by 淼淼兮 at 2014-01-12 10:42:45
我也准备做DGGE请问前辈 PCR产物是怎么纯化的 切胶回收？

不需要纯化，我是病急乱投医，是在找不到原因了，就想是不是PCR时用的mix不合适呢，所以切胶回收又跑了一下。你要做好失败的心理准备，而且是多次失败，祝你好运！
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8楼2014-01-14 19:34:52
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