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肥猫p木虫 (正式写手)
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[求助]
如何在丝状真菌中表达如何蛋白 已有1人参与
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大家好，说一下我要做的实验。 导师让我给丝状真菌的一个ORF有6kb的大基因挂上gfp或者mcherry之类的荧光标签，使之成为融合蛋白。 我这几天查文献，发现大家做融合蛋白基本都是将两个基因的ORF连接起来，然后在表达载体上进行表达。 但是这个丝状真菌没有表达质粒啊，只能进行基因组整合，所以我就不知道该怎么做了。 之前我是这么做的，通过2次重叠pcr，构建成这样的序列：上游同源片段+第一个基因的ORF（去终止密码子）+第二个基因的ORF+构巢曲霉的终止子TtrpC+抗性筛选标记HYGB+下游同源片段。 通过农杆菌侵染，上下游片段与丝状真菌的基因组进行同源重组双交换，确实筛选到了基因型正确的重组子。当时我第二个基因选的是gfp，但是不能发荧光，够来发现不能发光的原因是第一个基因不转录了！我并没有对第一个基因的启动子和整个ORF进行任何操作啊，只是在第一个基因的ORF后面加了gfp的ORF，然后再换了个终止子而已。我感觉只有更换终止子也会影响这个基因的转录，可以解释了。 那么我现在应该怎么做呢？怎么在不影响第一个基因的启动子、ORF和终止子的情况下，将gfp与它进行融合表达呢？那我的筛选标记放那啊？ 希望能得到大家的宝贵意见，谢谢大家！ |
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junqing
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