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风吹我已散

木虫 (正式写手)

[交流] 酶切问题

在19T上连了一个目的片段（大概1.6K），挑单克隆菌落培养，分别pcr和酶切验证目的片段在19T上的插入方向。根据我的目的基因的序列，选择了xbal酶切，该酶切位点在我的目的片段大概1.2K左右的位置上，也就是说如果是正向插入的话，酶切下来应该是3.9K和400bp的条带；反向插入的应该是1.2K和3.1k左右的条带。通过载体上的引物和我扩目的片段的引物pcr验证出了正向和反向插入（有正负对照）；但是酶切只能验证反向插入的（有1.2K和3.1k左右的条带），而正向插入的无400bp的条带。这个怎么解释？胶我试过1.5%和1.2%的，都没有。求帮助。
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1楼 2013-11-22 10:34:19
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)
★ ★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
风吹我已散: 金币+1 2013-11-22 13:08:18
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2013-11-22 16:23:44
酶切出来的小片段在胶上比较暗。增加点样量，应该可以看到的。
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2楼2013-11-22 11:22:00
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风吹我已散

木虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-11-22 11:22:00
酶切出来的小片段在胶上比较暗。增加点样量，应该可以看到的。

我试试看哈。
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3楼2013-11-22 13:08:31
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zh10246

铁杆木虫 (文坛精英)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
你的目的是什么，表达还是测序，最好的方法就是测序
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4楼2013-11-22 14:09:43
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风吹我已散

木虫 (正式写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by zh10246 at 2013-11-22 14:09:43
你的目的是什么，表达还是测序，最好的方法就是测序

以后要表达；老师说，先不用测序，pcr，酶切做了再说。
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5楼2013-11-22 14:12:07
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zh10246

铁杆木虫 (文坛精英)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
5楼: Originally posted by 风吹我已散 at 2013-11-22 14:12:07
以后要表达；老师说，先不用测序，pcr，酶切做了再说。...

19T是什么载体，表达载体，还是中间用的克隆载体?怎么还会有正反方向的问题，是不是设计引物的时候考虑不周全，还是没选择呢？
一般你做PCR把酶切位点加进去（用高保真的酶），酶切PCR产物和表达载体，连接直接构建表达载体，表达前测序验证正确就可以表达了。
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6楼2013-11-22 14:18:31
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huahu3600

新虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
PCR假阳性率很高
我更愿意相信酶切结果
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7楼2013-11-22 16:18:47
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风吹我已散

木虫 (正式写手)
引用回帖:
6楼: Originally posted by zh10246 at 2013-11-22 14:18:31
19T是什么载体，表达载体，还是中间用的克隆载体?怎么还会有正反方向的问题，是不是设计引物的时候考虑不周全，还是没选择呢？
一般你做PCR把酶切位点加进去（用高保真的酶），酶切PCR产物和表达载体，连接直接构 ...

PMD19-T载体，有正反向插入的问题。
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8楼2013-11-23 14:39:27
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风吹我已散

木虫 (正式写手)
引用回帖:
7楼: Originally posted by huahu3600 at 2013-11-22 16:18:47
PCR假阳性率很高
我更愿意相信酶切结果

是啊，就是正向酶切不成功，反向酶切和pcr都没问题。
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9楼2013-11-23 14:40:18
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zh10246

铁杆木虫 (文坛精英)
引用回帖:
8楼: Originally posted by 风吹我已散 at 2013-11-23 14:39:27
PMD19-T载体，有正反向插入的问题。...

这样就增加了你工作量，要选正确方向的
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10楼2013-11-23 14:41:25
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不叶珏

铁杆木虫 (正式写手)
加大点样量！
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11楼2013-11-23 20:27:32
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