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风吹我已散

木虫 (正式写手)

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[交流] 酶切问题

在19T上连了一个目的片段（大概1.6K），挑单克隆菌落培养，分别pcr和酶切验证目的片段在19T上的插入方向。根据我的目的基因的序列，选择了xbal酶切，该酶切位点在我的目的片段大概1.2K左右的位置上，也就是说如果是正向插入的话，酶切下来应该是3.9K和400bp的条带；反向插入的应该是1.2K和3.1k左右的条带。通过载体上的引物和我扩目的片段的引物pcr验证出了正向和反向插入（有正负对照）；但是酶切只能验证反向插入的（有1.2K和3.1k左右的条带），而正向插入的无400bp的条带。这个怎么解释？胶我试过1.5%和1.2%的，都没有。

求帮助。

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1楼 2013-11-22 10:34:19

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风吹我已散

木虫 (正式写手)

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引用回帖:

6楼: Originally posted by zh10246 at 2013-11-22 14:18:31
19T是什么载体，表达载体，还是中间用的克隆载体?怎么还会有正反方向的问题，是不是设计引物的时候考虑不周全，还是没选择呢？
一般你做PCR把酶切位点加进去（用高保真的酶），酶切PCR产物和表达载体，连接直接构 ...

PMD19-T载体，有正反向插入的问题。