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北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
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风吹我已散

木虫 (正式写手)


[交流] 酶切问题

在19T上连了一个目的片段(大概1.6K),挑单克隆菌落培养,分别pcr和酶切验证目的片段在19T上的插入方向。根据我的目的基因的序列,选择了xbal酶切,该酶切位点在我的目的片段大概1.2K左右的位置上,也就是说如果是正向插入的话,酶切下来应该是3.9K和400bp的条带;反向插入的应该是1.2K和3.1k左右的条带。通过载体上的引物和我扩目的片段的引物pcr验证出了正向和反向插入(有正负对照);但是酶切只能验证反向插入的(有1.2K和3.1k左右的条带),而正向插入的无400bp的条带。这个怎么解释?胶我试过1.5%和1.2%的,都没有。求帮助。
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风吹我已散

木虫 (正式写手)


引用回帖:
6楼: Originally posted by zh10246 at 2013-11-22 14:18:31
19T是什么载体,表达载体,还是中间用的克隆载体?怎么还会有正反方向的问题,是不是设计引物的时候考虑不周全,还是没选择呢?
一般你做PCR把酶切位点加进去(用高保真的酶),酶切PCR产物和表达载体,连接直接构 ...

PMD19-T载体,有正反向插入的问题。
8楼2013-11-23 14:39:27
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)


★ ★ ★ ★
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风吹我已散: 金币+1 2013-11-22 13:08:18
gyesang: 金币+2, 鼓励交流! 2013-11-22 16:23:44
酶切出来的小片段在胶上比较暗。增加点样量,应该可以看到的。
2楼2013-11-22 11:22:00
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风吹我已散

木虫 (正式写手)


引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-11-22 11:22:00
酶切出来的小片段在胶上比较暗。增加点样量,应该可以看到的。

我试试看哈。
3楼2013-11-22 13:08:31
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zh10246

铁杆木虫 (文坛精英)



小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
你的目的是什么,表达还是测序,最好的方法就是测序
4楼2013-11-22 14:09:43
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