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wumiaolemon新虫 (初入文坛)
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[求助]
蛋白质-琼脂糖电泳技术
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| 请问一下谁有蛋白质-琼脂糖凝胶电泳的实验步骤啊，包括各种试剂和配方方法，我们本来要做SDS-Page,但是老师说是试剂毒性比较大，换成琼脂-蛋白质实验，三十找不到方法，求各位高手指导 |
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myprayer
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【答案】应助回帖
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wumiaolemon: 金币+10, ★有帮助 2013-12-25 18:05:27
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不知道你说的蛋白质具体指什么，这里给你提供的是血清脂蛋白琼脂糖凝胶电泳。 将血清脂蛋白用脂类染料(如苏丹黑或油红O等)进行预染。再将预染过的血清置于琼脂糖凝胶板上进行电泳分离。通电后，脂蛋白向正极移动，并分离为几个区带。 原 理 将血清脂蛋白用脂类染料(如苏丹黑或油红O等)进行预染。再将预染过的血清置于琼脂糖凝胶板上进行电泳分离。通电后，脂蛋白向正极移动，并分离为几个区带。 操 作 1．预染血清：血清0.2ml加苏丹黑染色液0.2ml于小试管中，混合后置37℃水浴染色30分钟，然后离心(2000转/分，约5分钟)。 2．制备琼脂糖凝胶板：将已配制的0.45%琼脂糖凝胶于沸水浴中加热融化，用吸管吸取凝胶溶液浇注载玻片，每片2.5ml，静置约半小时后凝固(天热时需延长，可放冰箱数分钟加速凝固)。 3．点加血清：已凝固的琼脂糖凝胶板的一端约2cm处，用切口刀片垂直切入凝胶后立即取出，然后用铜丝小匙将长方小条凝胶取出。以小片滤纸吸干小槽中水分，用血色素吸管吸取经过预染的血清约15μl，注入凝胶板上的小槽内。 4．电泳：将加过血清的凝胶板平行放入电泳槽中，样品应在阴极一端。两块三层纱布于巴比妥缓冲液中浸润，然后轻轻紧密贴在凝胶板两端，纱布的另一端浸于电泳槽内的巴比妥缓冲液(注意：此电极缓冲液不能用三羟甲烷缓冲液代替)。接通电源，电压为120~130V，每片电流为3~4mA。约经电泳15至55分钟，即可见分离之色带。 注意事项 1．电泳样品要求为新鲜的空腹血清。 2．每一块凝胶上可平行挖两条小槽，因而可加两个样品。 3．如果用一形状大小和小槽一样的有机玻璃片，在琼脂糖胶凝固前固定于适当位子上，当凝固后取出有机玻璃片，凝胶板上留下小槽可直接加样，不需挖槽。 4．如果需要保留电泳样本，可将电泳后之凝胶板(连同玻片)放于清水中浸泡脱盐2小时，然后放烘箱(80℃左右)烘干即可。 试剂与器材 1．巴比缓冲液(pH8.6，离子强度0.075)：为电极缓冲液 巴比妥钠15.4g，巴比妥2.76g，EDTA酸0.292g，加水溶解后加水至1000ml 2．三羟甲基氨基甲烷缓冲液(pH8.6)为凝胶缓冲液 三甲基氨基甲烷1.212g，EDTA酸0.29g，NaCl 15.85g加水溶解后加水至1000ml 3．琼脂糖凝胶 琼脂糖0.45g，三痉甲基氨基甲烷缓冲液50ml，水50ml 加热至沸，待琼脂糖溶解后立即停止加热。 4．挖槽工具制作 切口刀：刀口长15mm的刀片，中央夹一有机玻璃或木片，用螺丝固定，使两刀片相距1.5mm。挖槽小匙：用直径1.5mm的铜丝约6cm长，一端锤成扁平，用砂纸磨光。 5．电泳槽和电泳仪：同血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳的仪器。 |
2楼2013-11-16 14:10:35