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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » DGGE跑胶，为啥PCR产物一直停留在浓缩胶，没有往变性胶跑下去？？
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stephenallan

金虫 (小有名气)

[求助] DGGE跑胶，为啥PCR产物一直停留在浓缩胶，没有往变性胶跑下去？？

最近在做DGGE，PCR产物一直停在点样孔下面，电泳就跑到浓缩胶底，没有再往变性胶跑。
PCR产物约在250bp.
变性胶10%gel，梯度试了两个35-55%，,55-70%，都没有成功。
电泳条件：80V，13h；300,3h；200v，5h都试了，一样没有跑下去。
想了好久，排除了一些原因，还是没有 弄明白！

求助，这是什么原因？
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1楼 2013-11-02 19:44:17
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牧炀

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰，手有余香。分子生物期待你更多精彩 。 2013-11-03 17:31:42

没图嘛...
1、检查下你配的TAE buffer的pH值是不是正常
2、你换一下引物，引物的bp值不要太大了，199bp的就差不多了(我也不知道你的是多大的)
3、调整下上样量，往小了调，比如5μl的可以换成3μl或者2μl的
4、虽然不太可能，但是检查下你的胶有没有灌反了，从上到下是不是低到高的
5、你可以先用高电压比如240V把DNA先冲下来，然后换到差不多130-140V这样跑5-6小时  或者80过夜跑个14-15个小时这样

祝实验顺利...
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2楼2013-11-02 21:20:13
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stephenallan

金虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 牧炀 at 2013-11-02 21:20:13

没图嘛...
1、检查下你配的TAE buffer的pH值是不是正常
2、你换一下引物，引物的bp值不要太大了，199bp的就差不多了(我也不知道你的是多大的)
3、调整下上样量，往小了调，比如5μl的可以换成3μl或者2 ...

别人用同一个仪器，TAE buffer一样，跑出东西了。
上样量是10μl，我看其他做的说是20-40μl的，还要往下调 么？为甚么哩 ？
灌胶这个是没错的，
第5个我试试看，谢谢~
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3楼2013-11-02 22:15:14
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stephenallan

金虫 (小有名气)
http://pan.baidu.com/s/1zh6n6

http://pan.baidu.com/s/1kU2jU

这是我跑的PCR产物
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4楼2013-11-04 16:07:14
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stephenallan

金虫 (小有名气)
求各路大神，慷慨帮助回复~
不胜感激
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5楼2013-11-04 16:09:40
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zq347597638

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

我想问下 你的引物是有GC夹子的吗
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6楼2013-11-09 09:23:21
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jxmingcyl

铁虫 (初入文坛)
你好，你的这个问题解决了吗？我也遇到这个麻烦了哦
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7楼2013-11-10 17:31:25
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银小耳

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

也有可能是你电极搞反了
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8楼2013-11-19 13:31:00
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轩尼骑士

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

胶浓度太大 改为8%最好
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9楼2013-11-25 17:32:36
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stephenallan

金虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by 银小耳 at 2013-11-19 13:31:00
也有可能是你电极搞反了

仪器就一个插头的，不会搞错正负极的^_^

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10楼2013-11-27 00:29:06
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