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半定量RT-PCR求助
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做半定量RT-PCR两个多月了，基本天天都拿从小鼠组织制取单细胞悬浮液提取RNA逆转录，然后PCR。之前用整个组织，只要模板的浓度大那么内参十多二十多个循环就能出现条带，目的基因三十多个循环就能出现条带。 昨天组会，老师说不能用整个组织来做，用组织来做半定量只是用来练手。要拿组织里边某种细胞亚群来做半定量这样才能得到更深入的结果。我们课题组可以用流式细胞分选仪从某组织单细胞悬浮液中分选出单一的细胞群，但是有的细胞群数量不多，分选一天也就可能得到80万个细胞（一般课题组研三的同学一周只能用分选仪一天）。我想问各位前辈，有人用过比较少的样品来提取过RNA吗。以我这段时间的经验，1.0-2.5X10^6个细胞的RNA在逆转录后只能得到20ul浓度为30-50ug/ml的cDNA（用的事天根的试剂盒）。用这样浓度的cDNA做出来的循环数不用太高PCR产物就饱和了。如果只用8X10^5或者几万个细胞来做逆转录，我做半定量的循环数可能就要到四五十个循环才出现条带了。循环数太大，会对实验造成影响吗。找了一些文献，中文的文献有部分还会涉及做实验具体的循环数而外文的文献直接把结果放上去的。求指导。 |
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