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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » Triton X-114法提取膜蛋白
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小墨825

新虫 (小有名气)

[求助] Triton X-114法提取膜蛋白

利用Triton X-114法分层得到膜蛋白（下层），怎么把Triton X-114去除？有没有可能将膜蛋白转移到水相？衷心求助！
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1楼 2013-09-17 18:52:04
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小墨825

新虫 (小有名气)
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3楼: Originally posted by 凌波丽 at 2013-09-17 22:28:53
要把表面活性剂与膜蛋白质拆开，用分子筛层析分离出表面活性剂的疏水层会结合的膜蛋白质后，放置于烧杯的水溶液中，然后加大水溶液的非极性即可，比如加入水溶中乙醚。

大神！！！您做过这方面是么，对于您的回答，我有几点疑问：
1. 分子筛要选择哪种？“用分子筛层析分离出表面活性剂的疏水层会结合的膜蛋白质后”这个我不是很理解，意思是说分子筛洗脱下来的是表面活性剂疏水层结合膜蛋白的部分是么？

2. 加大水溶液的非极性，就是把疏水端溶下来吗？将表面活性剂与膜蛋白分开？我需要保持蛋白的活性，乙醚可能会造成损失，并且这一步的温度和时间是否有需求？不知道您做的效果如何？

3.我查到一些文献用到bio-beads 用batch method来去除，不知道您有没有使用过？

非常感谢您，如再次应助，我会追加悬赏的，希望能多多指教。
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5楼2013-09-18 10:59:54
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小墨825

新虫 (小有名气)
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6楼: Originally posted by ynkuaile at 2013-09-18 11:52:01
膜蛋白在水相中可溶吗（我认为不可溶）？去除表面活性剂之后，蛋白还有活性吗（我认为会沉淀的）？将膜蛋白转移到水相的办法就是用表面活性剂。不可以去除表面活性剂。非要去除表面活性剂的方法也有很多，比如稀释， ...

我现在得到的下层很粘稠，不好进行下一步的纯化实验，目的是想去除Ttriton X-114.尝试过丙酮沉淀和透析，前者蛋白大量损失，后者根本透不出来，稀释很大倍数都透不出来。我可以使用低浓度的另外的表面活性剂进行置换，您觉得可行么？样品十分粘稠，过分子筛是否也不可行？稀释之后蛋白浓度又达不到，希望您再提意见！
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7楼2013-09-18 15:31:17
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小墨825

新虫 (小有名气)
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6楼: Originally posted by ynkuaile at 2013-09-18 11:52:01
膜蛋白在水相中可溶吗（我认为不可溶）？去除表面活性剂之后，蛋白还有活性吗（我认为会沉淀的）？将膜蛋白转移到水相的办法就是用表面活性剂。不可以去除表面活性剂。非要去除表面活性剂的方法也有很多，比如稀释， ...

我们之前过柱都不去除的，那是因为去垢剂的浓度低，现在经过两相分离，下层都是去污相，呈油状，我也不敢直接上柱，实验室只有superdex 200.但是也要置换成下一步的起始缓冲液，经过您这样提醒似乎置换才是我需要做的而不是去除，之前我也有闪过会出现沉淀的想法，或许还可以复溶？？？
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8楼2013-09-18 16:09:58
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小墨825

新虫 (小有名气)
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9楼: Originally posted by ynkuaile at 2013-09-18 19:46:31
对不起，我不太了解你的课题以及实验步骤，我能提供的帮助有限，只说一些个人想法，希望对你有用。
1. 我认为表面活性剂是一头亲水，一头疏水的，那么他与水溶液互溶时，我觉得有两种情况，要么油包水，要么水包油 ...

哎呀，您太谦虚啦！我就是利用Triton X-114的方法分层的，非离子表面活性剂Triton X-114溶液在0 ℃下分布均匀，但高于20 ℃时分为水相和去污相（含膜蛋白）。在初始溶液中加入1%的Triton X-114，进行多次分层，收集下层（占初始体积的六分之一左右）。这一部分呈油状，比较粘稠，我要做下一步的纯化，文献上柱层析里几乎都用Triton X-100.
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10楼2013-09-19 16:44:09
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小墨825

新虫 (小有名气)
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12楼: Originally posted by ynkuaile at 2013-09-23 19:12:33
我想TRITON X-114层再溶解的时候，最好TRITON X-114的浓度还为1%或更低。不知你稀释的倍数是多少，因为大量稀释后，表面活性剂在水溶液中会形成胶束，胶束的粒径可能比你透析或超滤的孔径都大，如果浓度高，那么表 ...

你的想法跟老师提的一样。初始溶液中加入1%的Triton X-114分为上层1和下层1，上层1继续加入1%的Triton X-114，再次分层，得到上层2和下层2，上层2重复上述步骤，得到下层3，合并下层1、2、3使用PBS进行分层，重复2次，得到最终的样品。所以我最终的样品Triton X-114的浓度稀释至原体积之后绝对超过1%了，我拿出一部分来做实验，随着浓缩的进行，溶液越来越黏稠，还是透不过超滤膜，可能稀释倍数还是不够大，浓度超过了cmc，大量稀释再浓缩很浪费时间啊！
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15楼2013-09-27 15:19:51
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小墨825

新虫 (小有名气)
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14楼: Originally posted by 凌波丽 at 2013-09-24 12:16:59
如果表面活性剂在稀溶液中形成了胶束，用透析可能失效，要看具体的胶束的大小，不能一概而论。同样在稀溶液中膜蛋白也会形成沉淀，但是两者的颗粒大小肯定不同，所以可以考虑使用超速离心分离两者。

分离后的膜蛋 ...

在稀溶液中膜蛋白也会形成沉淀，但是两者的颗粒大小肯定不同，所以可以考虑使用超速离心分离两者。——请问这一步的离心机转速要达到多少？就是因为实验室没有超速离心机所以才整得特别麻烦啊！
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16楼2013-09-27 15:21:50
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小墨825

新虫 (小有名气)
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17楼: Originally posted by zhzecai at 2013-10-19 22:56:35
您好，我有几个问题想请教您一下，外膜蛋白最终溶解在triton-114中能做直接细胞实验吗？我看有的文献上最终用丙酮进行蛋白质的沉淀，但是我怀疑蛋白质会不会失活啊？还有就算蛋白质沉淀了，那么用哪种溶液能溶解外 ...

我的经验是丙酮沉淀会大幅失活，不知道你的情况怎么样！
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18楼2013-11-27 10:17:06
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