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小墨825

新虫 (小有名气)

[求助] Triton X-114法提取膜蛋白

利用Triton X-114法分层得到膜蛋白（下层），怎么把Triton X-114去除？有没有可能将膜蛋白转移到水相？衷心求助！
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1楼 2013-09-17 18:52:04
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

凌波丽

专家顾问 (知名作家)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰，手有余香。分子生物期待你更多精彩 2013-09-17 22:41:16
TRITON X-114:2-(2-[4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl)phenoxy]ethoxy)ethanol;二乙二醇单[(1,1,3,3-四甲基丁基)苯基]醚;聚氧乙烯辛烷基苯酚醚，是一种表面活性剂，会结合到膜蛋白质的表面形成一层亲水层，而表面活性剂的疏水层会结合到膜蛋白质的分子表面，这样包裹了TRITON X-114的蛋白质本身就到了水溶液里
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2楼2013-09-17 22:24:52
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
小墨825: 金币+20, ★★★很有帮助 2013-09-18 15:31:42
要把表面活性剂与膜蛋白质拆开，用分子筛层析分离出表面活性剂的疏水层会结合的膜蛋白质后，放置于烧杯的水溶液中，然后加大水溶液的非极性即可，比如加入水溶中乙醚。
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3楼2013-09-17 22:28:53
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)
然后用透析和超滤很容易出去蛋白质溶液中的有机分子，留下蛋白质。
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4楼2013-09-17 22:31:27
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小墨825

新虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 凌波丽 at 2013-09-17 22:28:53
要把表面活性剂与膜蛋白质拆开，用分子筛层析分离出表面活性剂的疏水层会结合的膜蛋白质后，放置于烧杯的水溶液中，然后加大水溶液的非极性即可，比如加入水溶中乙醚。

大神！！！您做过这方面是么，对于您的回答，我有几点疑问：
1. 分子筛要选择哪种？“用分子筛层析分离出表面活性剂的疏水层会结合的膜蛋白质后”这个我不是很理解，意思是说分子筛洗脱下来的是表面活性剂疏水层结合膜蛋白的部分是么？

2. 加大水溶液的非极性，就是把疏水端溶下来吗？将表面活性剂与膜蛋白分开？我需要保持蛋白的活性，乙醚可能会造成损失，并且这一步的温度和时间是否有需求？不知道您做的效果如何？

3.我查到一些文献用到bio-beads 用batch method来去除，不知道您有没有使用过？

非常感谢您，如再次应助，我会追加悬赏的，希望能多多指教。
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5楼2013-09-18 10:59:54
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ynkuaile

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小墨825: 金币+20 2013-09-18 15:32:00
gyesang: 金币+3, 鼓励回帖应助！ 2013-09-20 00:57:24
膜蛋白在水相中可溶吗（我认为不可溶）？去除表面活性剂之后，蛋白还有活性吗（我认为会沉淀的）？将膜蛋白转移到水相的办法就是用表面活性剂。不可以去除表面活性剂。非要去除表面活性剂的方法也有很多，比如稀释，透析……，但是你的膜蛋白会沉或形成大的聚集体。如果你过分子筛，一定要加表面活性剂，不加的话，蛋白质到了没有表面活性剂助溶的溶液中就会析出，会堵你的分子筛的。表面活性剂一般不影响后续试验，建议保留或换另一种表面活性剂。
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6楼2013-09-18 11:52:01
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小墨825

新虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by ynkuaile at 2013-09-18 11:52:01
膜蛋白在水相中可溶吗（我认为不可溶）？去除表面活性剂之后，蛋白还有活性吗（我认为会沉淀的）？将膜蛋白转移到水相的办法就是用表面活性剂。不可以去除表面活性剂。非要去除表面活性剂的方法也有很多，比如稀释， ...

我现在得到的下层很粘稠，不好进行下一步的纯化实验，目的是想去除Ttriton X-114.尝试过丙酮沉淀和透析，前者蛋白大量损失，后者根本透不出来，稀释很大倍数都透不出来。我可以使用低浓度的另外的表面活性剂进行置换，您觉得可行么？样品十分粘稠，过分子筛是否也不可行？稀释之后蛋白浓度又达不到，希望您再提意见！
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7楼2013-09-18 15:31:17
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小墨825

新虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by ynkuaile at 2013-09-18 11:52:01
膜蛋白在水相中可溶吗（我认为不可溶）？去除表面活性剂之后，蛋白还有活性吗（我认为会沉淀的）？将膜蛋白转移到水相的办法就是用表面活性剂。不可以去除表面活性剂。非要去除表面活性剂的方法也有很多，比如稀释， ...

我们之前过柱都不去除的，那是因为去垢剂的浓度低，现在经过两相分离，下层都是去污相，呈油状，我也不敢直接上柱，实验室只有superdex 200.但是也要置换成下一步的起始缓冲液，经过您这样提醒似乎置换才是我需要做的而不是去除，之前我也有闪过会出现沉淀的想法，或许还可以复溶？？？
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8楼2013-09-18 16:09:58
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ynkuaile

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2013-09-20 00:57:34
引用回帖:
8楼: Originally posted by 小墨825 at 2013-09-18 16:09:58
我们之前过柱都不去除的，那是因为去垢剂的浓度低，现在经过两相分离，下层都是去污相，呈油状，我也不敢直接上柱，实验室只有superdex 200.但是也要置换成下一步的起始缓冲液，经过您这样提醒似乎置换才是我需要做 ...

对不起，我不太了解你的课题以及实验步骤，我能提供的帮助有限，只说一些个人想法，希望对你有用。
1. 我认为表面活性剂是一头亲水，一头疏水的，那么他与水溶液互溶时，我觉得有两种情况，要么油包水，要么水包油，我觉得分层的现象，应该不是去垢剂的原因，我觉得去垢剂与水是互溶的。不好意思，了解甚少。分层这点希望你能教我。
2. 你说之前过柱都不去除去垢剂，是因为浓度低。我觉得高浓度的表面活性剂能使蛋白质变性，尽管是非离子型的。浓度低一点能提取出来吗？我觉得几个CMC的浓度就应该可以了。
3. 换成另一种表面活性剂是可以的，但是选哪一种表面活性剂是难点。我觉得一般用一种便宜的去垢剂提取，后期换成需要的去垢剂。
互相学习，分层的现象麻烦你教我，你们实验室其他的也分层吗？
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9楼2013-09-18 19:46:31
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小墨825

新虫 (小有名气)
引用回帖:
9楼: Originally posted by ynkuaile at 2013-09-18 19:46:31
对不起，我不太了解你的课题以及实验步骤，我能提供的帮助有限，只说一些个人想法，希望对你有用。
1. 我认为表面活性剂是一头亲水，一头疏水的，那么他与水溶液互溶时，我觉得有两种情况，要么油包水，要么水包油 ...

哎呀，您太谦虚啦！我就是利用Triton X-114的方法分层的，非离子表面活性剂Triton X-114溶液在0 ℃下分布均匀，但高于20 ℃时分为水相和去污相（含膜蛋白）。在初始溶液中加入1%的Triton X-114，进行多次分层，收集下层（占初始体积的六分之一左右）。这一部分呈油状，比较粘稠，我要做下一步的纯化，文献上柱层析里几乎都用Triton X-100.
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10楼2013-09-19 16:44:09
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